ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 626-628
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК: 612.115.3:612.115.064
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСА И СМЕСИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА С АДЕНОЗИНТРИФОСФОРНОЙ КИСЛОТОЙ
© 2007 г. Л. А. Ляпина, В. Е. Пасторова, Т. Ю. Оберган
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119992 Москва, Ленинские горы, 1, кор. 12 Поступила в редакцию 25.09.2006 г.
Установлено увеличение антикоагулянтной и неферментативной фибринолитической активности плазмы крови крыс в возрасте 6-7 мес. как in vitro, так и после многократного внутримышечного введения комплекса гепарин-аденозинтрифосфорная кислота (Г-АТФ). Смесь гепарина с АТФ не обладала в условиях in vitro фибриндеполимеризационной активностью. При многократном внутримышечном введении животным смесь вызывала противосвертывающее действие, но в 1.5-1.6 раза менее выраженное, чем введение комплекса. Сделан вывод о большей эффективности комплекса Г-АТФ по проявлению антикоагулянтно-фибринолитических свойств сравнительно со смесью.
Внутримышечное введение животным комплексных соединений высокомолекулярного гепарина с аминокислотами, аминами, пептидами приводит к повышению антикоагулянтной активности крови, значительно превышающему ее эффект, достигаемый при введении эквивалентной по отношению к комплексу дозы гепарина (Kudrjashov, Lyapina, 1986; Кудряшов и др., 1992; Ульянов и др., 2004). Высокомолекулярный гепарин относится к антикоагулянтам быстрого действия и блокирует свертывающую активность тромбина (McKay, Laurell, 1980; Aster, 2006). Один из естественных низкомолекулярных лигандов, богатый энергией - АТФ, участвует в метаболизме аминосахаров (гексозаминов), наибольшее значение среди которых имеют глюкозамин, га-лактозамин, входящие в состав гепариновой молекулы (Марри и др., 1993). АТФ принимает участие во многих процессах обмена веществ в организме и его в основном применяют в комплексной терапии мышечной дистрофии и атрофии, при сердечно-сосудистой недостаточности и нарушениях сердечного ритма, а также при спазмах периферических сосудов. Экспериментальные данные показывают, что АТФ усиливает мозговое и коронарное кровообращение (Справочник..., 2003). В экспериментах на животных проводились исследования противосвертываю-щего действия комплекса Г-АТФ и доказана его эффективность (Ляпина и др., 2005). Однако возникает вопрос, так ли необходимо для повышения антикоагулянтного и фибринолитического статуса организма получать этот комплекс трудоемким и длительным методом или же возможно использовать смесь гепарина с АТФ?
С этой целью в настоящей работе проводились сравнительные исследования способности комплексного соединения высокомолекулярного гепарина с АТФ, а также смеси этих соединений повышать антикоагулянтно-фибринолитические свойства плазмы крови животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали высокомолекулярный гепарин фирмы "Serva" (США), препарат АТФ фирмы "Львовдиалек" (Украина, Львов).
Разработанным нами методом получали комплекс Г-АТФ и смесь гепарина с АТФ при весовом соотношении 1 : 20 (Ляпина и др., 2005).
В условиях in vitro (вне организма) проводили определение суммарной и неферментативной фибринолитической активности комплекса и смеси в пределах концентраций от 10-2 до 10-5 мг/мл.
Эксперименты in vivo были проведены на 40 лабораторных крысах-самцах в возрасте 7-8 мес. с массой тела 200-220 г . Животные были разделены на 2 серии: крысам из первой серии вводили комплекс Г-АТФ и его составные части в эквивалентных количествах, а из второй - смесь и ее составные части. Каждая из серий была разделена на четыре группы. Животным ежедневно внутримышечно в течение четырех сут (через каждые 24 ч) вводили препараты: 1-й и 5-й группам - комплекс Г-АТФ в дозе 1.3 мг/кг массы тела и смесь, состоящую из 1.24 мг АТФ + 0.06 мг гепарина/кг массы тела соответственно; 2-й и 6-й -АТФ по 1.24 мг/кг каждой; 3-й и 7-й - гепарин по 0.06 мг/кг каждой; 4-й и 8-й (контроль) - вводили 0.5 мл/200 г массы тела 0.85%-ного раствора NaCl
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
627
Таблица 1. Показатели гемостаза в плазме крови крыс после 4-кратного внутримышечного введения комплекса Г-АТФ в ежедневной дозе 1.3 мг/кг массы тела, гепарина или АТФ в дозах, эквивалентных их содержанию в комплексе
Через 1 ч после последней инъекции
Показатель крови, % комплекса Г-АТФ (1-я группа) АТФ (2-я группа) гепарина (3-я группа) 0.85%-ного NaCl (контроль) (4-я группа)
АЧТВ 210.0 ± 4.0** 142.3 ± 5.7** 150.0 ± 4.0** 100.0 ± 2.4
СФА 211.4 ± 7.2** 146.8 ± 5.4** 97.5 ± 6.0 100.0 ± 3.5
НФ 196.6 ± 8.4** 142.0 ± 3.7** 118.5 ± 5.8* 100.0 ± 3.7
ААП, мм2 246.6 ± 7.7** 201.9 ± 19.4** 112.6 ± 8.7 100.0 ± 3.7
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0.85%-ным раствором №С1. * р < 0.05. ** р < 0.01 (для табл. 1-2).
каждой. Для определения биохимических параметров гемостаза через 1 ч после последнего введения комплекса или смеси, а также их составных частей из vеna jugularis брали кровь в количестве 2 мл с использованием в качестве консерванта 3.8%-ного раствора лимоннокислого натрия. Производили определение следующих параметров свертывающей и противосвертывающей систем плазмы крови: суммарную (фибринолитиче-скую активность СФА) и неферментативную (НФ) фибринолитическую активность (Kudrjash-ov, Lyapina, 1986), активность тканевого активатора плазминогена (ААП) (Astrup, Müllertz, 1952), антикоагулянтную активность по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Долгов и др., 1996). Также в плазме определяли агрегацию тромбоцитов (АТ) на аг-регометре (Россия) с использованием в качестве агреганта раствора аденозиндифосфата в концентрации 2 мкМ (Долгов и др., 1996).
Полученные результаты были обработаны статистически по методу Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нами установлено, что в чистой системе (условия in vitro) комплекс проявлял СФА за счет НФА (зоны лизиса составляли 25-30 мм2), в то время как смесь или не обнаруживала фибринолитиче-ского действия, или оказывала слабый эффект (зоны лизиса составляли от 4 до 12 мм2). При этом установлено повышение АЧТВ комплекса Г-АТФ, в то время как смесь таковой не обнаружила. Интересно отметить, что АТ в присутствии и комплекса Г-АТФ, и смеси значительно снижалась при содержании препаратов в системе в концентрации 10-2-10-3 мг/мл. Следовательно, в условиях in vitro комплекс Г-АТФ отличался от смеси значительным эффектом по АЧТВ и НФА. Однако и комплекс, и смесь снижали АТ, т.е. прояв-
ляли антиагрегационную активность практически в равной степени.
При проведении экспериментов на животных показано, что через 1 ч после 4-кратного внутримышечного введения комплекса Г-АТФ (1-я группа) достоверно увеличивалось АЧТВ плазмы в 2.1 раза, СФА в 2.1, НФА - почти в 2 раза, ААП в 2.5 раза по сравнению с контрольной группой, получавшей 0.85%-ный раствор КаС1.
Введение крысам эквивалентной по отношению к комплексу Г-АТФ дозы АТФ (2-я группа) приводило в достоверному увеличению АЧТВ плазмы уже в 1.4 раза, СФА в 1.5, НФА в 1.4, ААП в 2 раза по сравнению с теми же показателями у контрольных крыс. Внутримышечное введение эквивалентной по отношению к комплексу Г-АТФ дозы гепарина (3-я группа) не изменяло исследуемых параметров гемостаза за исключением АЧТВ плазмы, которое имело тенденцию к увеличению, по сравнению с контрольной группой (4-я группа) (табл. 1).
Через 1 ч после внутримышечного 4 -кратного введения смеси Г-АТФ (5-я группа), АТФ (6-я группа) и гепарина (7-я группа) в эквивалентной дозе сохранялся повышенный фон АЧТВ, СФА, ААП и НФА плазмы при сравнении с теми же показателями плазмы после введения 0.85%-ного раствора КаС1 (8-я группа). Следует отметить резкое повышение в этот период антикоагулянтно-фибринолитических свойств плазмы крови после введения одной АТФ (табл. 2).
Следовательно, при сравнении противосвер-тывающих активностей смеси и комплекса Г-АТФ установлены значительные эффекты именно комплекса по сравнению со смесью по проявлению СФА в плазме крови, ее НФА, ААП плазмы крови, хотя и смесь достоверно повышает указанные активности при введении в организм животных. Показано, что и смесь, и комплекс
ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ < 5 2007
8*
628
ЛЯПИНА и др.
Таблица 2. Показатели гемостаза в плазме крови крыс после 4-кратного внутримышечного введения смеси Г-АТФ в ежедневной дозе 1.3 мг/кг, гепарина или АТФ в дозах, эквивалентных их содержанию в смеси
Через 1 ч после последней инъекции
Показатель крови, % смеси Г-ATФ (5-я группа) ATФ (6-я группа) гепарина (7-я группа) 0.85%-ного NaCl (контроль) (8-я группа)
AЧTB 209.8 ± 14.3** 144.9 ±10.3** 271.0 ± 26.9* 100.0 ± 14.3
CФA 129.8 ± 4.6** 132.8 ± 6.9** 117.7 ± 2.3* 100.0 ± 3.6
HO 147.0 ± 10.0** 137.5 ± 4.5** 124.5 ± 2.5 100.0 ± 5.0
AAn, мм2 191.2 ± 14.3** 210.1 ± 10.1** 146.1 ± 8.8 100.0 ± 12.1
Г-АТФ оказывали одинаковый антикоагулянт-ный эффект, определяемый по АЧТВ. Составная часть АТФ - Г-АТФ комплекса и смеси гепарина с АТФ также достоверно, хотя и в меньшей степени, чем комплекс Г-АТФ, повышала антикоагу-лянтно-фибринолитический фон плазмы крови в экспериментах in vivo. Многократное внутримышечное введение животным гепарина в дозе, эквивалентной его содержанию в комплексе или смеси, не способствовало достоверным изменениям со стороны антикоагулянтно-фибринолитиче-ского фона плазмы крови крыс.
Таким образом в работе показано, что при сравнении противосвертывающих эффектов комплекса Г-АТФ и смеси наибольший противо-свертывающий эффект обнаруживает комплекс Г-АТФ, что свидетельствует о более длительном его сохранении в кровотоке по сравнению со смесью гепарина с АТФ. В смеси составных компонентов только АТФ оказывает антикоагулянтно-фибринолитическое действие в кровотоке. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу применения именно комплекса Г-АТФ, а не смеси в случае возникновения пред- или тромботиче-ских состояний в организме.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Долгов В.В, Авдеева H.A., Щетникович К.А
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.