научная статья по теме CRISPR-СИСТЕМЫ: МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Физика

Текст научной статьи на тему «CRISPR-СИСТЕМЫ: МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ»

CRISPR-системы: механизм действия и применения

А.А.Гоглева, И.И.Артамонова

В предыдущей статье* мы рассказали о недавно открытых в геномах большинства прокариот (45% бактерий и 85% архей) не кодирующих белки участках — CRISPR. Напомним, у этой структуры есть «тело» — кассета, состоящая из коротких прямых повторов, разделенных уникальными последовательностями (спейсерами), и «голова» — лидерная последовательность, которая, по-видимому, регулирует транскрипцию CRISPR-кассе-ты, а значит, и функционирование всей системы. Глядя на ее обобщенный «портрет», исследователи предположили, что CRISPR-структуры нужны прока-риотической клетке, возможно, для сегрегации хромосом, репарации ДНК, иммунной защиты от вирусов или просто служат горячим локусом рекомбинации геномов, предоставляя эволюции все новые и новые возможности для выбора самых приспособленных форм. Какая же из гипотез оказалась верной?

Функция CRISPR

Люди научились одомашнивать не только коров и собак, но и бактерий. Streptococcus thermo-philus — одна из ключевых одомашненных микробных куль* См.: ГоглеваАА,АртамоноваИ. И. CRISPR-системы: структура и гипотетические функции // Природа. 2014. №6. С.16—21.

© Гоглева А.А., Артамонова И.И., 2014

Анна Анатольевна Гоглева, аспирант группы биоинформатики отдела вычислительной системной биологии Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (ИОГен). Занимается изучением СШБРК-систем прокариотического иммунитета в микробиоме человека.

Ирена Игоревна Артамонова, кандидат биологических наук, руководитель группы биоинформатики ИОГен, доцент Московского государственного университета имМ.ВЛомоносова, старший научный сотрудник Учебно-научного центра «Биоинформатика» Института проблем передачи информации им.А.А.Харкевича РАН. Область научных интересов — эволюционная геномика, биоинформатика, аннотация геномов.

тур — используется для получения сыров, йогуртов и других молочнокислых продуктов**. Бактерии, даже самые полезные, тоже болеют. Существенное беспокойство молочной промышленности постоянно доставляет подверженность 8ЛЪвтшорЫ1ш различным вирусным инфекциям. Неслучайно именно на этом модельном организме были получены ключевые экспериментальные данные для подтверждения функции CRISPR-систем.

Оказалось, что если заразить живую культуру ЗЛЪвтшорЫЫь бактериофагами, большинство бактерий погибнет, а очень небольшая часть выживет. Если затем секвенировать CRISPR-кассеты выживших клонов, то выяснится, что в любой из них число спейсеров уве-

** Подробнее см.: Суворов АН. Полезные микробы — кто они? // Природа. 2009. №7. С.21—30.

Рис.1. Направленное включение новых спейсеров в CRISPR-кассету.

личилось: в кассете каждого клона появилось от одного до четырех дополнительных спейсеров рядом с лидерной последовательностью [1]. При повторном заражении теми же бактериофагами все клоны выживали.

Как будто, переболев вирусной инфекцией, бактерия стала немного опытнее и записала себе в «медицинскую карту» что-то важное об этом вирусе, и такая инфекция ей теперь не страшна. Действительно, новые спейсеры оказались комплементарны участкам генома заразившего ее вируса. Получается, что CRISPR-кассета — это история болезней бактерии, а спейсеры соответствуют записям об отдельных инфекциях. Если теперь искусственно вырезать из вирусного генома небольшие фрагменты и вставить их в виде новых спейсеров, то клетка окажется невосприимчива к исходному вирусу, даже если никогда раньше с ним не встречалась. Наблюдение оказалось верным и в обратную сторону: при удалении из CRISPR-кассет спей-серов, подобных последовательностям данного ба-ктриофага, исчезала и устойчивость к нему [1]. Эта серия простых и изящных экспериментов на ЗЛЫвт-торЫйш полностью подтвердила гипотезу об иммунной функции CRISPR-систем.

Что же происходит дальше с выжившей бактерией и вновь встроенным спейсером? По своему происхождению он полностью совпадает с участком фагового генома (протоспейсером) и обеспечивает полную защиту: этой клетке данный вирус не страшен. Если таких клеток много, то вирус вряд ли преуспеет в заражении большого числа бактерий и не сможет размножиться в массовых количествах, а значит, он вымрет. Не случись по-

вторного заражения тем же вирусом, спейсер в кассете долго не задержится: со временем он просто будет утерян в результате рекомбинации между повторами кассеты.

Заметим, что вирус тоже не бездействует — он умеет «убегать» от CRISPR-иммунитета за счет точечных мутаций, накапливаемых в последовательности протоспейсера. Интересно, что единичные замены в некоторых из них сразу лишают бактерию устойчивости к вирусу, замены в других лишь несколько ослабляют ее. В любом случае, когда протоспейсер теряет сходство с бактериальным спейсером, как злоумышленник, сделавший серию пластических операций, становится непохож на себя, пропадает и устойчивость. Теперь клетку при заражении спасет только встраивание нового спейсера из данного бактериофага.

Полярная манера включения новых спейсеров (рис.1) в состав CRISPR-кассет позволяет буквально читать историю взаимоотношений прокариот и их вирусов на определенном эволюционном промежутке. Таким образом, CRISPR — это не только иммунитет, но еще и память о недавних победах прокариотической клетки.

Механизм работы

Какие же молекулярные механизмы обеспечивают CRISPR-опосредованный иммунитет? Правильнее говорить о работе CRISPR/Cas-системы. Ведь только за счет сложных белковых машин из Cas-белков CRISPR-кассетам и удается реализовать защитную функцию.

Рис.2. Основные этапы CRISPR-опосредованного иммунного ответа.

CRISPR/Cas-система работает в три этапа (рис.2): приобретение новых спейсеров (адаптация), созревание эффекторных комплексов и разрушение чужеродной ДНК (иммунный ответ).

Адаптация. Когда клетку с CRISPR-системой заражает вирус, из его генома вырезается небольшой фрагмент и встраивается в кассету в качестве спейсера [1]. При множественных повторных заражениях одним и тем же агентом включение первого спейсера, даже если он из-за случайных мутаций не обеспечивает полной защиты, ускоряет приобретение дополнительных спейсеров против того же самого чужеродного репликона (вируса или плазмиды). Это явление назвали прайми-рованием [2]. Несколько спейсеров повышают шансы справиться с инфицирующим агентом даже при неполном совпадении спейсеров и прото-спейсеров. Лидерная последовательность — это «точка роста» CRISPR-кассеты. С ней взаимодействуют белковые машины, отвечающие за включение новых спейсеров. Без лидерной последовательности кассеты не могут расти [3].

Привилегированных вирусных и плазмидных генов, служащих источником протоспейсеров, нет, однако это не совсем случайные последовательности. В вирусных геномах рядом с протоспейсерами находятся короткие, обычно длиной в два-три нук-леотида, мотивы, или PAM (от. англ. protospacer

adjacent motif) [4]. По-видимому, это — участки связывания важных для выщепления протоспейсе-ра белков и, кроме того, своеобразные подсказки для CRISPR-системы, что найденный спейсером участок относится к чужеродной ДНК.

Ключевые игроки на стадии приобретения новых спейсеров — белки Cas1 и Cas2 [5]. В некоторых случаях они даже слиты для удобства в один белок. Такая белковая машина работает последовательно: сканирует чужеродную ДНК в поисках PAM-последовательности; вырезает протоспей-сер; распознает лидерную последовательность и вставляет новый спейсер с дополнительной копией повтора рядом с ней.

Созревание эффекторных комплексов. Спейсеры — своего рода пассивная иммунная память. Для защиты от интервентов нужно перевести ее в активный иммунный ответ. Это происходит тоже в несколько стадий. Сначала СRISPR-кас-сета активируется (экспрессируется), что приводит к образованию длинной молекулы первичного РНК-предшественника. Экспрессия запускается благодаря регуляторной области в составе лидерной последовательности. Одновременно начинают синтезироваться Сas-белки. Из них строится скелет активного эффекторного комплекса. У кишечной палочки (Escherichia coli) такой комплекс, названный Cascade [6], состоит из молекул пяти

Рис.3. Структура СаБсаСе-комплекса [7].

белков и по форме отдаленно напоминает морского конька (рис.3).

Комплекс из Cas-белков нарезает длинный первичный РНК-предшественник на короткие РНК (CRISPR-РНК или, кратко, мРНК), соответствующие последовательности одного спейсера, обрамленной неравными по длине участками повторов [6]. Субъединицы белкового комплекса расположены в пространстве так, что между ними образуется спиральная бороздка, в которую вкладывается «РНК. Cas-белки с намотанной на них «РНК составляют готовый к сражениям эффекторный комплекс.

Иммунный ответ. Правильно сориентированная сгРНК в составе комплекса может комплементарно взаимодействовать с протоспейсером вирусной или плазмидной ДНК. Однако нужно не просто узнать чужеродную нуклеиновую кислоту, но и уничтожить ее. У Е.соИ за это отвечает эн-донуклеаза Cas3, которая может резать как одно-цепочечную, так и двухцепочечную ДНК. Важно, что Cas3 разрезает ДНК очень эффективно и совсем не специфично. Эффекторные Cas-crРНК-комплексы, напротив, очень специфично узнают последовательности, комплементарные спейсе-ру, изменяют свою конформацию и только после этого рекрутируют и правильным образом усаживают на ДНК белок Cas3 [8]. Особенно важны для такого узнавания семь якорных нуклеотидов на границе протоспейсера и PAM-мотива. Если между якорным участком и сгРНК есть различия хотя бы в один нуклеотид, то CRISPR-опосредо-ванный иммунитет не сработает. Единичные отличия «РНК от протоспейсера за пределом этой якорной области допускаются и уже не так драматически влияют на успех CRISPR-иммунитета. По мере накопления одноцепочечных разрывов в ДНК-мишени сродство эффекторного комплекса к ней снижается: он отсоединяется и распадается на отдельные субъединицы. Cas3 вносит большое число разрывов начиная с места своей

посадки и далее в более или менее случайной манере, кроша ДНК интервента. Возможно, короткие фрагменты ДНК, образованные в результате работы Cas3, служат заготовками для новых спейсеров. Такая преемственно

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком