МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ, ОБРАЗУЕМЫХ МАЛЫМИ БЕЛКАМИ ТЕПЛОВОГО ШОКА С ДЕНАТУРИРОВАННЫМ АКТИНОМ
© 2008 г. А.В. Пивоварова*, Н.А. Чеботарева*, Н.Б. Гусев**, Д.И. Левицкий* ***
*Институт биоxимии им. А .Н. Баxа PАН, 119071, Моеква, Ленинский просп., 33;
**Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991,
Моеква, Воробьевы горы;
***Научно-исследовательский институт физико-xимической биологии им. А .Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Воробьевы горы
Поступила в p едакцию 06.05.08 г.
Исследовано влияние pекомбинантного малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 27 кДа (Нsp27) как дикого типа (Hsp27-wt), так и с мутациями S15D, S78D и S82D (Hsp27-3D), имит^ующими фоcфоpилиpование этого белка, на тепловую денатуpацию и а^ егацию Ф -актина. Показано, что пp и весовом отношении Н sp27/актин, pавном 1/4, как Hsp27-wt, так и Hsp27-3D не оказывают влияния на тепловую денатуpацию Ф-актина, но ^и этом эффективно пpедотвpащают его последующую а^егацию путем обpазования небольших pаcтвоpимыx комплексов с денатуpиpованным актином. 06pазование таких комплексов ^о^ходит только пp и нагp евании и ornp овождает тепловую денатуp ацию Ф -актина. Известно, что Hsp27-wt существует в виде больших выcокомолекуляpных олигомеpов, тогда как Hsp27-3D обpазует лишь небольшие димеpы или тетpамеpы. В то же вpемя pезультаты пpоведенныx нами экcпеpиментов по динамическому cветоp ассеянию свидетельствуют о том, что комплексы, обp азуемые Hsp27-wt и Hsp27-3D с денатуpиp ованным актином, не pазличаютcя по своему pазмеpу (по значению гидpодинамического pадиуса, pавному в обоих случаях 17 - 18 нм). Однако коэффициенты седиментации этих комплексов несколько pазличалиcь: в случае Hsp27-3D они pас^еделялись в диапазоне от 10 до 45 S, а в случае Hsp27-wt - в области 18-60 S. Таким обpазом, исходное олигомеpное со стояние Hsp27 не оказывает существенного влияния на способность этого белка обpазовывать небольшие pаcтвоpимые комплексы с денатуp иpованным актином.
Ключевые слова: актин, малые белки теплового шока, дифференциальная сканирующая калориметрия, динамическое светорассеяние, аналитическое ультрацентрифугирование.
Актин - один из наиболее распространенных белков в природе. Образуемые им фила-менты (Ф -актин) являются одним из о сновных компонентов цитоскелета, а их взаимодействие с головками молекул миозина, сопряженное с гидролизом АТФ, лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации [1,2]. Накопление агр егированного белка представляет собой серьезную угрозу для жизнедеятельно сти клетки, и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, - таких, как актин. Для предотвр а-
Сокращения: Д СК - дифференциальная сканирующая калориметрия, 8НБР - малые белки теплового шока, Нр27 -малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 27 кДа, Нр27-%1; - рекомбинантный Нр27 дикого типа, Нр27-3Б - Нр27 с мутациями Б15Б, Б78Б и Б82Б, имитирующими его фосфорилирование.
щения формир ования нер астворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспр ессия малых белков теплового шока (sHSP).
sHSP - большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (так называемого а-кристаллинового домена) в C-концевой части [3]. Многие из малых белков теплового шока образуют большие олигомер ные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономер ов [4]. Было показано, что in vitro многие sHSP могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатур и-рованных белков [4,5], причем эта их способность зависит от четвер тичной структуры sHSP [6,7]. В клетках многие sHSP подвергаются фосфор илир ованию под действием различных про-теинкиназ, что сопровождается изменением их
олигомерного состояния и шаперонной активности [3,4].
В ответ на различные неблагоприятные воздействия, такие, как тепловой шок, экспр ессия некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Шр27) значительно увеличивается, и их наибольшее количество обнаруживается именно в мышечных тканях [4], где содержание актина также очень велико. Можно предположить, что одна из функций таких sHSP заключается во взаимодействии с актином. В ряде исследований были сделаны попытки проанализировать взаимодействие некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Шр27, ^р20) с нативными актиновыми филаментами. Результаты этих исследований, однако, весьма противоречивы и не подтверждают того, что sHSP могут связываться с нативным Ф -актином. Было показано, что в ответ на стресс sHSP могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое пер емещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов [8-10]. И сходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что sHSP взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких, как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совер шенно неясным.
В предыдущих работах мы показали, что sHSP не влияют на тепловую денатурацию Ф -актина, но эффективно предотвращают последующую агрегацию денатурированного белка [2]. В последующих экспериментах мы использовали главным образом мутантную форму ^р27 с заменой трех остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты, в дальнейшем именуемую ^р27-3Б. Эти мутации, как было показано ранее [11], имитируют фосфорилирование Шр27 под действием МАPКАP2 киназы, происходящее in vivo при воздействии неблагоприятных факторов и в условиях стресса [8]. Важно отметить, что рекомбинантный Шр27 дикого типа (^р27-^) образует крупные неоднородные по размеру олигомеры с высокой молекулярной массой (более 600 кДа), а его фосфорилирование вызывает диссоциацию крупных олигомеров до димер ов или тетрамер ов. Аналогичные результаты были получены и для ^р27-3Б, имитир уещего такое фосфорилирование: он не образует крупных олигомеров, а существует в растворе в виде димеров или тетрамеров [7,12]. Именно это свойство ^р27-3Б позволило нам провести целый ряд экспериментов по исследованию взаимодействия малых белков теплового шока с денатурированным актином.
Методом соосаждения было показано, что после пр огрева Ф -актина в пр исутствии И8р27-3Б денатур ир ованный актин не осаждается при ультрацентрифугировании, а обнаруживается в супернатанте вместе с И8р27-3Б, тогда как на-тивный Ф -актин и Ф -актин, прогретый в отсутствие И8р27-3Б, полностью осаждаются в тех же условиях [2]. И сходя их этих данных, мы предположили, что И8р27-3Б и другие малые белки теплового шока способны образовывать небольшие, стабильные и хор ошо растворимые комплексы с денатурированным актином, предотвр ащая таким обр азом его агрегацию. В дальнейших экспериментах мы достаточно подробно исследовали свойства таких комплексов, образуемых И8р27-3Б с актином в процессе тепловой денатурации Ф-актина.
Методом динамического светорассеяния нам удалось оценить гидродинамический радиус (Я комплексов И8р27-3Б с денатурированным актином, оказавшийся в условиях насыщения, равным ~17 нм. К роме того, этим же методом нам удалось показать, что такие комплексы стабильны и не меняют своих свойств после охлаждения до комнатной температуры [13]. Используя метод аналитического ультрацентрифугирования, мы определили еще один важный параметр, характеризующий размеры таких комплексов, - их коэффициенты седиментации. Оказалось, что в условиях, близких к насыщению (при весовых соотношениях И8р27-3Б/актин, близких к единице), коэффициенты седиментации таких комплексов рас-пр еделялись в диапазоне от 10 до 25 8, а ср еднее значение коэффициента седиментации составляло около 19 8. Эти данные указывают на то, что актин после денатурации в присутствии И8р27-3Б образует неоднор одные по составу и стр уктуре комплексы с И8р27-3Б, обладающие относительно небольшими размерами [13].
На основании этих данных был предложен механизм взаимодействия И8р27-3Б с денатурированным актином [13], согласующийся с р а-нее предложенным диссоциативным механизмом денатурации Ф-актина [1]. Тепловой денатурации Ф -актина предшествует их диссоциация, т.е. актиновые филаменты денатурируют не целиком, а в виде небольших олигомеров, диссоциирующих с их концов. Эти олигомеры актина легко подвергаются денатурации, которая в отсутствие 8И8Р сопр овождается агрегацией. Именно с такими денатурированными олигомерами актина и взаимодействуют 8И8Р, предотвращая их дальнейшую агрегацию путем образования относительно небольших растворимых комплексов.
В данной pаботе мы ^одолжили исследование механизма взаимодействия малых белков теплового шока с денатуp Hp ованным актином. Напомним, что pанее мы анализиpовали только комплексы, полученные в пpиcутcтвии Hsp27-3D, не обp азующего кpупны х олигомеpов. Возник во^о с - влияет ли исходное олигомеp ное состояние Hsp27 на его способность ^едот-вp ащать агpегацию денатуpиpованного актина и обpазовывать с ним pаcтвоpимые комплексы? Для ответа на этот во^ос мы пpовели cpав-нительный анализ пpоцеccов денатуpации и аг-pегации Ф-актина в npисутствии Hsp27-3D и белка дикого типа (Hsp27-wt), существующего в виде ^упных олигомеpов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение белков. Актин получали из скелетных мышц ролика по cтандаpтной методике [14]. Мономеpный Г-актин полимеpизовали в филаменты Ф-актина, добавляя к нему MgCl2 до концентpации 2 мМ. Пеpед экcпеpиментами Ф-актин pазбавляли до необходимой концен-тpации буфеpом, cодеpжащим 30 мМ HEPES, 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2 (pH 7,3). Реком-бинантные белки Hsp27-3D и Hsp27-wt клони-pовали, экcпpеccиpовали и выделяли, как описано pанее [15]. Р аcтвоpимые комплексы актина с Hsp27-3D или Hsp27-wt получали, нагpевая смесь Ф-актина и Hsp27 с постоянной cкоpо-стью 1°С/мин до полной денатуpаци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.