БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1000-1007
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3 + 544.01
СВЯЗЬ МЕЖДУ МЕХАНИЧЕСКИМИ И ЭЛЕКТРИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГИДРОГЕЛЯ, ВЫБРАННОГО В КАЧЕСТВЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ЦИТОСКЕЛЕТА
© 2008. Т.Ф. Шкляр, А.П. Сафронов*, И.С. Клюжин*, Дж. Поллак**, Ф.А. Бляхман
Уральская государственная медицинская академия, 620219, Екатеринбург, ул. Репина, 3; *Уральский государственный университет им. А.М. Горького, 620083, Екатеринбург, пр. Ленина, 51;
**Университет Вашингтона, Сиэтл 98195, США E-mail: Tatyana.Shdyar@usu.ru.
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Исследована корреляция между значениями электрохимического потенциала (Доннана) и процессом объемного набухания синтетических полиэлектролитных гидрогелей, взятых в качестве аналога гелеобразующих биополимеров, формирующих цитоскелет. Методом радикальной полимеризации в водном растворе синтезированы гидрогели на основе полиакриловой и полиметакриловой кислот, различающиеся плотностью сетки. Электрический заряд полимерной сетки обеспечивали частичной нейтрализацией мономерных кислот (гидро)оксидами ряда щелочных и щелочно-земельных металлов. Электрохимический потенциал (Доннана) синтетических гелей определяли по традиционной микроэлектродной методике, применяемой для измерения клеточных потенциалов. Для широкого набора анионных гелей с различной степенью заряженности и разной плотностью сетки показано, что отрицательный электрический потенциал уменьшается по мере уменьшения равновесной степени набухания, т.е. с уменьшением содержания воды в геле. Показано, что+резк,ий фазовый переход структуры геля от набухшего до сжатого состояния под влиянием К /Са -обмена сопровождается аналогичным уменьшением абсолютных значений потенциала Доннана гелей. В результате кинетических исследований обнаружено, что изменения объема геля предшествуют изменению его потенциала. На этом основании сделано предположение о том, что объемный фазовый переход в геле является основной причиной электрического отклика. Продемонстрировано подобие между переходом набухание/коллапс в синтетическом геле и объемными изменениями цитоскелета вблизи клеточной мембраны. На основании универсальной аналогии свойств синтетических и природных полимерных гелей сделано предположение о возможной роли процесса набухания гелеподобных структур цитоскелета в регуляции электрических явлений в клетке.
Ключевые слова: цитоскелет, полиэлектролитный гель, электрохимический потенциал, фазовый переход.
Цитоскелет живой клетки представляет собой трехмерную сеть белковых нитей, погруженную в жидкую фазу цитозоля. С физико-химической точки зрения, белковая ионно-вод-ная структура цитоскелета напоминает синтетический полиэлектролитный гель с рыхлой полимерной сетью, набухшей в растворителе. Типичная архитектура таких гелей состоит из сети поперечно сшитых полимерных нитей с электрическими зарядами.
Полиэлектролитные гели представляют собой материалы, характеризующиеся способностью значительно изменять свой объем за счет поглощения растворителя. При воздействии на них различных физических и химических фак-
Сокращение: КПМАК - полиметакриловая кислота.
торов, например, температуры, рН, изменения ионного состава среды, гели демонстрируют существенные структурные преобразования от набухшего состояния до коллапса и наоборот. Такие резкие преобразования получили название фазового перехода в геле, подобно тому, как вода при температурах кристаллизации и кипения превращается из жидкости в лед или пар.
Общепринято считать, что электрические свойства клетки связаны с неравномерным распределением ионов по обе стороны мембраны, т.е. с различной концентрацией ионов внутри и снаружи клетки. При этом в формировании электрохимического потенциала клетки ведущую роль приписывают специализированным мембранным каналам и насосам [1].
Между тем, согласно экспериментальным фактам, в синтетических полиэлектролитных гелях в отсутствие каких-либо каналов и насосов также имеет место электрохимический потенциал, близкий по своему значению к внутриклеточному [2]. Кроме того, было показано, что распространение волны изменения мембранного потенциала в клетке (потенциал действия) сопровождается набуханием гелеподоб-ных структур цитоскелета, расположенных непосредственно под мембраной [3]. На основании этого была выдвинута гипотеза, согласно которой электрическая активность клетки тесно связана со свойствами внутриклеточного геля, включая фазовые переходы в нем при особых условиях [2-5].
Настоящая работа посвящена изучению электрохимического потенциала в синтетических полиэлектролитных гелях в зависимости от степени их набухания. Степень набухания геля есть величина, характеризующая количество растворителя, поглощенного сухим полимером. Изменение степени набухания качественно отражает механические преобразования в геле в виде его сжатия или набухания за счет вытеснения или поглощения части растворителя полимерной сетью материала.
В данном исследовании степень набухания геля варьировали за счет добавления в растворитель ионов кальция в различных концентрациях. При этом электрохимический потенциал геля был измерен при двух экспериментальных условиях - статическом и динамическом. В статике потенциал был определен при фиксированных значениях степени набухания, тогда как в динамике потенциал фиксировался во время изменения степени набухания геля. В результате проведенных исследований получены данные, свидетельствующие в пользу существования тесной взаимосвязи между механическими преобразованиями в геле и его электрическими свойствами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы гели поли-метакриловой кислоты (КПМАК), синтезированные в результате свободнорадикальной полимеризации частично нейтрализованной ме-такр иловой кислоты с К,1Ч'-метилен-диакрила-мидом в качестве сшивающего агента в водном растворе. Были использованы реагенты фирмы Merck (БсИисИагё!;, Hohenbrunn). Готовили раствор метакриловой кислоты в воде с добавлением гидрооксида калия, взятом в количестве, требуемом для нейтрализации заданной доли метакриловой кислоты. Общая концентрация
мономерной кислоты и ее соли составляла 2,7 М. В полученный раствор вводили сшивающий агент в количестве, обеспечивающем заданное число мономерных звеньев линейного полимера на один узел сетки. Полимеризацию проводили под действием инициатора - персульфата аммония при 70°C в течение 1 ч в специальной цилиндрической форме. После окончания синтеза гели вынимали из формы и промывали в дистиллированной воде в течение двух недель при ежедневной смене воды для удаления низкомолекулярных примесей. В работе представлены результаты исследования гелей КПМАК 200-25 и КПМАК 100-50. Первое число в маркировке - среднее число звеньев линейных участков, приходящихся на один узел сетки, второе число - процент солевых групп метакрилата калия по отношению к общему числу звеньев.
Статические условия эксперимента. В статических исследованиях образцы геля, набухшие в дистиллированной воде, помещали в растворы с различной концентрацией ионов кальция (от 0,001 до 10 мМ CaCy не менее чем на 48 часов до достижения равновесного состояния, после чего проводили измерения электрохимического потенциала и равновесной степени набухания.
Электрохимический потенциал ф определяли с помощью микроэлектродной техники, стандартно используемой для фиксации электрохимических потенциалов в живой клетке. В частности, применяли два идентичных хлорсе-ребряных электрода, погруженных в стеклянные микропипетки с диаметром кончика около одного микрона и заполненные 3 М раствором KCl. Один электрод погружали в образец геля, второй в окружающий раствор. Разницу потенциалов между электродами измеряли при помощи усилителя на базе интегральной схемы INA 129 (Burr-Brown, CfflA). Пример получаемых данных представлен на рис. 1, где изображена типичная зависимость потенциала от времени. Детали экспериментальной установки подробно изложены в нашей работе [2].
В каждом образце проводили не менее 10 измерений потенциала, после чего установленные значения усредняли. Затем гели вынимали из растворов, взвешивали, высушивали в сушильном шкафу и вновь взвешивали сухой остаток. Cтепень набухания а рассчитывали как отношение веса набухшего в соответствующем растворе образца к весу остатка после полного высушивания. Таким образом, величина а количественно характеризовала, во сколько раз увеличивался вес образца геля после набухания в соответствующем растворителе.
Рис. 1. Пример экспериментальной записи электрохимического потенциала в гидрогеле. Стрелками отмечены моменты времени погружения и извлечения электрода из геля.
Динамические условия эксперимента. Для
каждого образца измерения электрохимического потенциала проводили в течение трех часов, начиная с момента перенесения геля из дистиллированной воды в раствор с соответствующей концентрацией СаС^. Потенциал регистрировали с интервалом, равным 10 мин, путем многократного (10 раз) погружения электрода в образец, на основании чего определялось среднее значение ф для данного отсчета времени.
Для изменения динамики объемных характеристик геля в растворах различной концентрации ионов Са2+ была разработана оптическая установка, блок-схема которой изображена на рис. 2. В качестве объекта исследования использовали цилиндрические образцы геля примерно 10x3 мм (рис. 2, справа). Применяли видеокамеру (Samsung VP-W80) формата Hi8 с выходным сигналом формата PAL. Камера была сопряжена с персональным компьютером (IBM PC), где видеоизображения объекта оцифровывались с помощью аналого-цифрового устройства (СопехаП bt878). Для обработки изображений была использована оригинальная программа в среде <Фе1рЫ», позволяющая количественно оценить линейные размеры образца в любом направлении, а также площадь видимой поверхности геля и полную абсолютную погрешность вычисления площади.
Статистическую обработку данных осуществляли стандартными методами с использованием программы MiCTosoft Ехсе1.
Рис. 2. Схема оптической видеосистемы для измерения объема образцов геля, справа - внешний вид образцов геля
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.