БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, с.842-848
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3; 57.043
СХОДСТВО ВО ВЛИЯНИИ РАЗНЫХ P ЕЖИМОВ КР ИОКОНСЕР ВАЦИИ СЕМЯН НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ
© 2008 г. Е.П. Четверикова, Э.В. Шабаева, С.Г. Яшина
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3
Поступила в p едакцию 30.11.07 г. После доработки 17.04.08 г.
Исследованы морфологические признаки 35 видов дикорастущих растений после замораживания семян пр и быстром и пр ограммном дву ступенчатом режимах о хлаждения до -196°C и неглубокого замор аживания до -10°C. Семена хранили в замороженном со стоянии в течение месяца. Семена всех изученных видов характер изовались низкой влажностью. Изучены полевая и лабораторная всхожесть семян, рост листьев, количество и длина побегов, количество генеративных органов, а также изменчивость этих признаков. Оказалось, что направление изменений признаков при разных режимах охлаждения и хранения одинаково, за исключением лабораторной всхожести у некоторых видов. Изменения определялись не способом охлаждения, а видовыми особенностями растений.
Ключевые слова: влажность семян, криоконсервация, способы замораживания, всхожесть, морфологические признаки растений.
Возможно сть длительного сохр анения семян и успешной их криоконсервации связана с их обезвоживанием при созр евании. П р и этом происходит увеличение экспрессии многих генов, приводящее к изменению всего метаболизма семян. Происходит синтез белков, ди- и оли-госахар идов, роль которых в сохранении внутриклеточных структур при обезвоживании цитоплазмы известна ср авнительно давно. П ред-полагают, что образующиеся гидрофильные белки (LEA белки) поглощают ионы, способствуя понижению ионной силы при концентр и-ровании клеточного содержимого, и стабилизируют структуру макромолекул, образуя водородные связи. Растворимые сахар а, также образуя водородные связи и заменяя воду, поддерживают гидр офильные структуры, когда свободной воды уже нет, а остается вода, связанная с белками, с крахмалом и иммобилизованная в структуре мембран [1].
В последние годы появились исследования, указывающие на изменение фазового состояния клеточного содержимого при обезвоживании, на переход его из пересыщенного раствора в стеклоподобное со стояние и на существенную роль этого состояния для сохранения семян. Стеклообразное, аморфное метастабильное состояние жидкости характеризуется необыкновенно высокой вязкостью [2]. Полагают, что в этом состоянии внутриклеточного содержимого иммобилизуются метаболиты и прекращается метаболизм.
Переход пересыщенной жидкости в стеклообразное состояние (витр ификация) зависит от температуры и содержания воды. Показано, что при низкой влажности, характерной для зрелых ортодоксальных семян, внутриклеточное
содержимое находится в стеклообразном состоянии. Это установлено методом диффер ен-циальной сканирующей калориметрии для зародышей семян пшеницы (Triticum vulgare) [3], фасоли (Phaseolus vulgaris) [4], гороха (Pisum satinum) и рогоза (Typha latifolia) [5] и других семян [6]. Более подробно стеклование в семенах при положительных температурах и наблюдавшаяся пр и этом очень высокая вязкость, останавливающая метаболизм и старение, описаны в обзоре [2].
Семена до температуры жидкого азота обычно охлаждают либо непосредственным погружением в жидкий азот, либо используют программный метод. В случае программного замораживания применяют сначала медленное охлаждение со скоро стью чаще всего 0,5 - 1°С в минуту. Смысл медленного о хлаждения со -стоит в том, что вода из клеток переходит во внеклеточное пространство и там замерзает. Пер вый этап медленного замор аживания проводят до температуры -30°С, или чаще до -40°С, затем объект переносят в жидкий азот [7-8]. При другом методе, быстром замораживании, когда объект непосредственно помещают в жидкий азот, скорость его охлаждения составляет несколько сот градусов в минуту.
Влияние разных способов замораживания на семена дикорастущих растений мало исследовано. Для ортодоксальных семян показано, что медленное замораживание программным, двуступенчатым методом не имеет преимуществ перед быстрым, путем погружения в жидкий азот [9-11]. С другой стороны, масличные семена кунжута (Sesamum indicum) [8] и хвойных деревьев [12] лучше переносят двуступенчатый
СХОДС ТВО ВО ВЛИЯНИИ РАЗНЫХ РЕЖИМОВ К РИОКОНСЕ РВАЦИИ Таблица 1. Влажность семян дикор астущих травянистых растений, в % к сыр ому весу
Название вида M ± m
Борец северный (A conitum septentrionale Koelle) 5,67 ± 0,07
Ветр еница лесная (Anemone sylvestris L.) 5,32 ± 0,16
Гвоздика Борбаша (Diantus borbasii Vandas) 7,16 ± 0,12
Гвоздика Фишер а (Diantus fischeri Spreng.) 7,14 ± 0,25
Гвоздика пышная (Diantus superbus L.) 6,47 ± 0,04
Горец змеиный (Polygonum bistorta L.) 6,48 ± 0,06
Донник белый (Melilotus albus Medik.) 5,6 ± 0,13
И рис водяной (Iris pseudacorus L.) 6,29 ± 0,10
И рис сибирский (Iris sibirica L.) 6,78 ± 0,07
Купальница европейская (Trollius europaeus L.) 7,74 ± 0,42
Колокольчик болонский (Campanula bononiensis L.) 5,13 ± 0,11
Колокольчик жестковолосистый (Campanula cervicaria L.) 5,42 ± 0,11
Колокольчик крапиволистный (Campanula trachelium L.) 5,27 ± 0,2
Колокольчик персиколистный (Campanulapersicifolia L.) 5,14 ± 0,06
Колокольчик сборный (Campanulaglomerata L.) 5,52 ± 0,25
Лунник оживающий (Lunaria rediviva L.) 5,17 ± 0,10
Нивяник обыкновенный (Leucanthemum vulgare Lam.) 4,25 ± 0,13
Прострел раскрытый (Pulsatillapatens (L.) Mill.) 5,31 ± 0,17
Рябчик русский (Fritillaria ruthenica Wikstr.) 5,72 ± 0,41
Таволга обыкновенная (Filipendula vulgaris Moe^h) 6,14 ± 0,05
Хатьма тюрингенская (Lavatera thuringiaca L.) 6,86 ± 0,10
Шалфей луговой (Salvia pratensis L. ) 6,64 ± 0,11
Шпажник чер епитчатый (Gladiolus imbricatus L.) 6,39 ± 0,26
Чина весенняя (Lathyrus vernus (L.) Bernh.) 6,55 ± 0,27
Примечание: результаты представлены средним арифметическим c ошибкой M ± m.
способ замораживания. Влияние кр иоконсерва-ции оценивали преимущественно по всхожести семян.
Задачей настоящей работы было исследование влияния скорости и глубины замораживания семян 35 видов дикорастущих травянистых растений на их всхожесть, а также на рост и развитие выросших из них растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В опытах использовали два режима глубокого замораживания семян - быстрое, путем погружения ампул с семенами в жидкий азот (скоро сть 700°С в минуту), и пр ограммное дву-ступенчатое - сначала до -40 С со скоростью
1°С в минуту с последующим погружением в жидкий азот.
П рименяли также неглубокое, имитирующее пр ир одные условия, замор аживание до -10°С. Семена находились в замор оженном состоянии в течение месяца, затем их оттаивали при комнатной температур е. Семена высевали в грунтовый питомник, где определяли их полевую всхожесть. Одновременно с посевом в грунт проводили определение лабораторной всхожести в чашках Петри в 3 - 5-кратной повтор-ности. Процессы роста и развития растений исследовали биометрическим методом: длина черешка, длина и ширина листовой пластинки, диаметр цветка, количество побегов и генеративных органов (бутонов, цветков и плодов). Количество растений в выбор ке было 30. Кон-
Таблица 2. Лабораторная всхожесть и жизнеспособность семян, подвергнутых глубокому и неглубокому замораживанию (в %)
Вид Контроль Глубокое замораживание (-196°C) Неглубокое заморажива-
Быстр ое П р ограмм-ное ние (-10°C)
1. Колокольчик персиколистный ЛВ* 95 ± 2 97 ± 2 94 ± 2 94 ±2
(Campanula persicifolia) Ж ** 99 ± 1 99 ± 1 95 ± 1 95 ±2
2. Шалфей луговой (Salvia pratensis) ЛВ 77 ± 3 81 ± 5 78 ± 3 81 ± 2
Ж 88 ± 2 89 ± 3 89 ± 1 92 ± 2
3. Донник белый (Melilotus albus) ЛВ 28 ± 5 82 ±_2 88 ±_4 15 ±5
Ж 93 ± 2 93 ± 1 100 100
4. Чина весенняя (Lathy rus vernus) ЛВ 20 ± 14 47 ±_3 73 ±_8 25 ± 0
5. Колокольчик болонский (Campanula bononiensis) ЛВ 75 ± 5 62 ±_7 58 ±_5 58 ±_8
6. Колокольчик жестковолосистый (Campanula cervicaria) ЛВ 46 ± 10 25 ±_3 32 ±_5 52 ±5
7. Колокольчик кр апиволистный (Campanula trachelium) ЛВ 43 ± 1 37 ±_1 31 ±_3 23 ±_5
8. Купальница европейская (Trollius europaeus) ЛВ 72 ± 2 46 ±_J 49 ±_2 60 ±_3
9. П рострел р а скр ытый (Pulsatilla patens) ЛВ 87 ± 4 70 ±_3 75 ±_9 69 ±_3
10. Таволга обыкновенная (Filipendula vulgaris) ЛВ 70 ± 3 39 ±_4 64 ±_6 73 ±5
Примечания. ЛВ* - лабораторная всхожесть; Ж** - жизнеспособность. Результаты представлены средним арифметическим с ошибкой M ± m. Разница достоверна, если цифры подчеркнуты. Доверительный интервал - 95%.
тр ольными служили семена, которые сохраняли при +5°С. Влажность семян определяли в 3-кратной повторности, высушивая навески при 105°С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты опр еделения влажности в семенах некоторых видов дикорастущих растений представлены в табл. 1. Можно видеть, что содержание воды в воздушно-сухих семенах низкое и колеблется от 4 до 8 г на 100 г сырого веса, что соответствует влажности ортодоксальных семян.
Существенно, что при исследовании фазового состояния цитоплазмы зародышей семян показано, что пр и таком низком содержании воды цитоплазма витрифицирована, находится в стеклообразном состоянии при положительных температурах. Так, методами дифференциальной сканирующей калориметрии и ЭП Р показано, что зародыши семян горо ха находятся в стеклообразном состоянии при 20°С и влаж-
ности до 16% от сухого веса [2,13]. Другими авторами методом ЭПР показано, что цитоплазма тканей зародышей семян бука (Fagus sylvatica), имеющих влажность до 9%, находится также в стеклообр азном со стоянии пр и положительных температурах [14]. Полагают, что стеклование содер жимого клеток пр и положительных температурах может обеспечиваться определенным соотношением сахаров (сахарозы и раффинозы) [15].
Сопоставление результатов по определению содержания воды в семенах (табл. 1) с литер а-турными данными [2,13-15] позволяет предполагать, что исследуемые нами семена дикор ас-тущих растений также находятся в витрифици-рованном со стоянии при комнатной темпер а-туре. Из этого следует, что пр оцессы метаболизма в них остановлены из-за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.