БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 843-847
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА=
УДК 577.3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУЛЛЕРЕНА C60 В КОМПЛЕКСЕ
С ПОЛИВИНИЛПИРРОЛИДОНОМ
С Ав(1-42)-ПЕПТИДОМ МОЗГА in vitro
© 2014 г. А.Г. Бобылёв*, Ю.В. Шаталин*, И.М. Вихлянцев*, Л.Г. Бобылёва*,
С.В. Гудков* ** ***, З.А. Подлубная* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3; ***Институт общей физики им. А .М. Прохорова РАН, 119991, Москва, 119991, ул. Вавилова, 38
E-mail: bobylev7@rambler.ru Поступила в p едакцию 11.06.14 г.
C помощью спектрофотометрического метода были проанализированы изменения, происходящие в растворе, содержащем АР(1-42)-пептид мозга, фуллерен Сбо и поливинилпирролидон. Методом Бента-Френча были определены относительные константы связывания фуллерена Сбо с АР(1-42)-пептидом и поливинилпирролидона с АР(1-42)-пептидом. Полученные данные позволяют предположить, что АР(1-42)-пептид при взаимодействии с комплексом (Сбо)^ПВПт частично вытесняет поливинилпирролидон и формирует новый тримолекулярный агрегат.
Ключевые слова: А в(1-42)-пептид, фуллерены, константы связывания фуллерена.
Фуллер ены - молекулярные соединения, принадлежащие к классу аллотропных форм углерода и представляющие собой полициклические структуры сферической формы, состоящие из атомов углерода, связанных в шести-и пятичленные циклы (р ис. 1). Первоначально возможность существования структуры, состоящей из 60 углеродных атомов (фуллерена С60), была обоснована теоретически [1]. Открытие фуллеренов принадлежит Крото и Смолли [2], которые, используя лучевую лазерную установку, зафиксировали особую стабильность Сбо и С7о, а затем предложили первые структурные изображения этих молекул.
Фуллерен С60 благодаря своей структуре подвергается окислению только в жестких условиях, но способен легко восстанавливаться. Поэтому основными типами реакций являются нуклеофильное, радикальное присоединение или реакция циклоприсоединения (реакция Дильса-Альдера) [3-6]. Поскольку молекула фуллерена является сильным акцептором электронов и свободных радикалов, фуллерены были названы «радикальными губками» [7]. Помимо сильных антиоксидантных свойств у фул-
Сокращение: ПВП - поливинилпирролидон, С60/ПВП -комплекс фуллерена С60 с ПВП.
леренов были открыты другие биологические свойства: ингибирование протеазы ВИЧ-1, фотомодификация ДНК, нейропротекция и т.д. [8-10]. Фуллерены нерастворимы в полярных растворителях, поэтому для изучения биологических свойств используются стабильные коллоидные растворы фуллеренов в воде [11], не-ковалентные комплексы фуллеренов с гидро-фильными органическими молекулами, в том числе с полимерами (например, комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидонами (ПВП) и циклодекстр инами), а также синтезированные водорастворимые производные фуллеренов.
Первые эксперименты по биологическим свойствам фуллер енов были направлены на изучение токсикологических характеристик. При исследовании растворов фуллер ена в о рганиче-ских растворителях или в воде (в виде «мик-ронизированных» образцов) не было найдено отрицательных эффектов [12]. Изучалось также действие «микронизированных» образцов фуллерена Сбо на рост 22 различных микробных линий (5 штаммов E. coli, 2 штамма P. aeruginosa, б штаммов S. Typhimurium, 2 штамма S. aureus, 2 штамма L. monocytogenes, E. hirae, B. cereus, B. subtilis, B. pumilus и C. Albicans). При этом не было обнаружено никакого влияния фуллерена на рост бактерий. Такие же
Рис. 1. Бакминстерфуллерен или букибол (кратко фуллерен С60).
результаты были получены при исследовании токсичности в опытах на культурах моноцитов, лейкоцитов и макрофагов человека [13].
В дальнейшем, с использованием различных методов растворения фуллеренов и их производных в полярных ра створителях, как у самого фуллерена, так и у его производных, было найдено большое число различных типов биологической активности, в том числе противовирусные и противомикробные свойства, способность расщеплять ДНК и т.д. [14].
При использовании фуллеренов как лекарственных веществ можно выделить три направления:
1. И спользование самого фуллерена как источника биологической активности.
2. И спользование модифицированных водорастворимых производных фуллерена, в которых фуллереновый остаток является фармако-фором, т.е. определяет биологический эффект.
3. И спользование модифицированных водорастворимых производных фуллерена, в которых остаток фуллерена используется лишь в качестве основы, а биологический эффект определяется фармакофорными группами на периферии молекулы.
Биологическое действие фуллеренов обуславливается прежде всего тем, что молекула фуллерена компактна. Например, диаметр молекулы Сбо равен ~ 0,71 нм (при молекулярной массе 720 Да), что сравнимо с размерами органических молекул, таких как бензол, фени-лаланин, и меньше размера более сложных молекул, таких как аденозинмонофосфат. Фуллерен Сбо и его производные являются сильными акцепторами электронов. Важным для биологии и фармакологии свойством молекулы фуллер е-на является ее способность превращать при освещении молекулу обычного триплетного ки-слор ода в синглетный кислород, что позволяет
рассматривать фуллерены как потенциальные препар аты для фотодинамической терапии [15].
Было показано, что 1,2-(диметоксимета-но)фуллерен способен ингибир овать р анние стадии агр егации A в(1-40)- и A в(11-25)-пептидов мозга, специфично связываясь с центральным гидрофобным мотивом KLVFF (Lys-Leu-Val-Phe-Phe) AP-пептидов [16].
Ранее мы показали, что фуллер ен C60 и ряд его производных способны разрушать амилоидные фибриллы А в(1-42)-пептида мозга, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера, а также мышечного X-белка [17-21]. Из полученных результатов был сделан вывод, что фул-лерен Сбо и его производные можно рассматривать как потенциальные антиамилоидные препараты. Возможный механизм действия фул-лерена Сбо и его пр оизводных на амилоидные фибриллы - это гидрофобное взаимодействие.
Также мы получили один из самых выра-женных антиамилоидных эффектов на амилоидные агр егаты Ав(1-42)-пептида у комплекса фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном, который эффективно действует на амилоиды исследованного пепетида, поскольку отдельно по-ливинилпирролидон не способен был препятствовать агрегации Ав(1-42)-пептида и разрушать его уже сформированные агрегаты. В этой работе нами была поставлена задача изучить взаимодействия фуллерена Сбо в комплексе с поливинилпирролидоном (С60/ПВП) с Ав(1-42)-пептидом мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальный материал. В исследованиях был использован синтетический AP(1-42)-пептид фирмы Sigma-Aldrich. Комплекс фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном с молекулярной массой ПВП 1оооо и содержанием в нем фуллер ена о,5-о,б%, полученный по методу [22], предо ставлен Л .Б. Пиотровским (Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург).
Спектрофотометрический анализ. Регистра -цию спектров поглощения проводили в стандартных 1-сантиметровых кварцевых кюветах на спектрофотометре Сагу 1оо Varian (Varian, Австралия). После получения серии спектров поглощения растворов, содержащих 5 мкМ AP(1-42)-пептида и различные концентрации фуллерена Сбо (о,25-1о мкМ), определяли оптическую плотность при 23о, 2б4, 344 и 524 нм. Для определения со става фор мируемых комплексов и констант связывания пр оводили анализ зависимости: n-lg([L ]) = lg([ALJ) -lg(P^-[A ]),
ВЗАИМОДЕЙ С ТВИЕ ФУЛЛЕРЕНА Сбо
845
Рис. 2. Электронная микрофотография агрегатов Сбо/ПВП (а) и агрегатов Сбо/ПВП, связанных с участком амилоидной фибриллы Ав(1-42)-пептида (б). Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.
по методу Бента-Ф р енча, где [A ] - концентр а -ция Aß(1-42)-пептида, [L] - концентрация ли-ганда (комплекс фуллерен Сб0-поливинилпир-р олидон), [ALn] - концентр ация комплекса A ß(1-42)-пептид-фуллеp ен Сб0-поливинилпир-ролидон, n - стехиометрический коэффициент, ßft - относительная константа связывания [23].
Электронная микроскопия. Каплю суспензии комплекса фуллер ена Сб0 с поливинилпирроли-доном в концентр ации 0,1 мг/мл нано сили на покрытую углеродом коллодиевую пленку на медной сеточке и негативно окрашивали 2% водным ра створ ом ур анилацетата [24]. Обр азцы просматривали на электронных микроскопах JEM-100B (Jeol, Япония) и LIBRA 120 (Саг1 Zeiss, Гер мания) пр и увеличении 40000х. Увеличение микроскопа было тестировано по пар акр исталлам пар амиозина с о севой пер иодич-ностью 14,5 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным электр онной микр о скопии, С60/ПВП фо р мир овал редкие агр егаты диаметр ом до 50 нм (р ис. 2а). Электр онно-микр о ско-пический анализ показал отсут ствие каких-либо агр егатов в обр азцах, содер жащих только ПВП. Поэтому агр егаты, наблюдаемые нами на электр онно -микр о скопических фотогр афиях, возможно, пр инадлежат фуллер ену С60. Также мы получили снимки, на котор ых агр егаты С60/ПВП связывались с заранее сформированными амилоидными фибр иллами А в(1-42)-пеп-тида. Молекулы А в(1-42)-пептида в пр исутст-вии С60/ПВП не фо р мир овали амилоидных фибр илл и других агр егатов [25]. Вследствие чего мы пр едположили, что С60/ПВП связывается с А в(1-42)-пептидами, тер минируя пр оцесс агр е-гации этих пептидов в амилоидные фибр иллы.
P ис. 3. Спектр поглощения поливинилпирролидона в водном р аствор е.
Идея эксперимента заключалась в определении типа взаимодействия фуллер ена С60 с амилоидным белком. В качестве модельного амилоидного белка был использован пептид А в(1-42). Фуллер ен С60 не обладает до статочной растворимостью в водных растворах, поэтому в данной работе мы использовали комплекс фуллер ена С60 с поливинилпирролидоном.
Водный р а створ поливинилпирролидона обладает интенсивной полосой поглощения пр и 230 нм (рис. 3).
В стр уктур е спектр а водного ра створ а комплекса С60/ПВП появляются новые полосы поглощения пр и 524, 344 и 264 нм (р ис. 4). Устойчивость данного комплекса со хр аняетс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.