БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, c.740-743
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 5 77.323:543.253:615.2 75.4
ДЕСТАБИЛИЗАЦИЯ И СТАБИЛИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ПОЛИ(А)ПОЛИ(У) СОЕДИНЕНИЯМИ ДВУХВАЛЕНТНОЙ
ПЛАТИНЫ
© 2008 г. А.А. Богданов, Ю.В. Иванов*, Н.А. Касьяненко, С.А. Потехин**, М .А. Суржик*, А. Л. Тимковский*, С. А. Феофанов***, Р.С. Хусаинова****, К.И. Яковлев*****
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург; *Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина Ленинградской области; **Институт белка РАН, 142290, Пущино Московской области; ***Филиал института биоорганической xимии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,
Пущино Московской области; ****Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области; *****Санкт-Петербургская государственная xимико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург
Поступила в p едакцию 01.02.07 г. Поме доpаботки 20.12.07 г.
C позиций молекуляpной биофизики np едложена и экcпеp иментально обоснована методология анализа BHyTp имолекуляp ной cтpуктуpной упоpядоченноcти полинуклеотидного дуплета по-ли(А)-поли(У). Показано, что оптимальным является сочетание стеклоcкопии кpyгового диxpоизма и диффеpенциальной cканиpyющей калоpиметpии. Такой подxод позволяет ана-лизиpовать влияние большого чиста xимичеcкиx cоединений на cтpyктypy поли(А)-поли(У) пpи pазличных ycловияx взаимодейcтвия. Иccледования напpавлены на получение нового высокоактивного пpотивовиpycного пpепаpата.
Ключевые слова: полинуклеотидные индукторы интерферона, соотношения структура-активность.
Появление новых вирусов и штаммов c эпи-демичеcким потенциалом тpебует pазpаботки малотоксичных пpофилактичеcкиx противовирусных cp едcтв c максимально шиpоким спек-тpом действия, cpеди которых выделяются полинуклеотидные индуктоpы интеpфеpона [1,2], в особенности дуплекcы cинтетичеcкиx поли-pибонуклеотидов. Однако таким дуплетам cвойcтвенны cпецифичеcкие cтpуктуpные осо-бенноcти, учет котоpыx необxодим для получения макcимально активных и минимально токcичныx пpепаp атов [3]. Оказалось полезным пpедставление о третичной cтpуктуpе дуплек-cов, включающей набоp двунитевыx участков, pазделенныx локальными внутримолекулярными структурными дефектами [3,4]. Cнижение чиcла дефектов в дуплекcаx должно пpиводить к упо-pядочению иx cтpуктуpы, увеличению cpедней
Сокращения: цис-ДДП - цис-диамминдихлор-платина (II), КД - круговой дихроизм, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, цис-ДГАДП - цис-дигидроксил-аминдихлор-платина (II).
длины регулярных участков и, как следствие, к повышению активности. Такой подход совершенно оригинален и развивается только в нашей стр ане. Типы дефектов различаются для дуплексов разного нуклеотидного состава, отсюда следует необходимость подбора разнообразных способов регуляризации их структур ы. Подобная задача для дуплекса поли(Г)-поли(Ц) была решена с применением электрохимических методов [5,6].
В свете этого особенно интересен поиск способов повышения противовирусной активности дуплекса поли(А)-поли(У) как заведомо малотоксичного и при этом удобного для промышленного изготовления. Он включен в Российскую Фармакопею («Полудан«), однако вследствие невысокой активности пригоден пока лишь для местного применения. Ранее было обнаружено, что взаимодействие этого дуплекса с цис-диамминдихлор-платиной (II) (цис-ДДП) заметно повышает его биологическую активность [7]. Мы предположили, что в поли(А)-поли (У) имеются дефекты специфического типа, обусловленные ло-
ДЕСТАБИЛИЗАЦИЯ И СТАБИЛИЗАЦИЯ CTPYKTYPbl
741
CneKTpbi KpyroBoro диxpоизма поли(А)-поли(У) и поли(А)-поли(У), модифициpованного соединениями платины: крестик - поли(А)-поли(У); светлый кружок - поли(А)-поли(У) + cis-ДДП (гь = 0,1); треугольник - поли(А)-поли(У) + K01 (rb = 0,03); перевернутый треугольник - поли(А)-поли(У) + K02 (гь = 0,05); звездочка - поли(А)-поли(У) + K03 (гь = 0,1); сложный крестик - поли(А)-поли(У) + cis-ДГАДП (гь = 0,1).
кальной переориентацией участков цепей по-ли(У) и их аномальным взаимодействием с атомами N(7) аденина. Поскольку атомы N(7) пуринов являются основной мишенью действия соединений платины в нуклеиновых кислотах [8], активацию можно объяснить блокированием цис-ДДП атомов N(7) [4]. Это должно приводить к увеличению средней длины участков регуляр ного спар ивания аденин-ур ацил и, следовательно, к повышению жесткости и тер мо-стабильности дуплекса. Однако использование цис-ДДП нецелесообразно вследствие высокой токсичности этого соединения [9] и его бифун-кциональности, способной привести к образованию шпилек и других нежелательных модификаций. Актуален поиск более подходящих координационных соединений Pt(II), так как различные группы и лиганды в первой координационной сфере могут по-разному влиять на структуру и стабильность дуплексов.
Для поиска оптимальных соединений Pt(II) и режимов их взаимодействия с поли(А)-поли(У) мы предлагаем оптимальную методологию и пр иводим экспериментальные доказательства того, что в данном случае наиболее информативным является сочетание спектро скопии кр у-гового дихроизма (КД) и дифференциальной сканирующей калориметр ии (Д C К).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дуплекс поли(А)-поли(У) получали по стандартной методике из полинуклеотидов, синте-зир ованных с помощью иммобилизованной по-
линуклеотидфосфорилазы [7]. Были синтезированы и использованы следующие би- и монофункциональные соединения Pt(II): цис-ДДП, цис-дигидроксиламиндихлор-Р^П) (цис-ДГАДП), цис-диамминцитозинмонохлор-Р^П) (К 01), транс-ди-амминцитозинмонохлор-Р^П) (К02), цис-диаммин-дезоксицитидинмонохлор-Р^П) (К03). Эти соединения выдер живали в смеси с поли(А)-поли(У) в течение 24 ч пр и комнатной температуре в 0,005 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4 с 0,05 М NaClO4. Спектры КД регистрировали на дихр ографе модели IV фир мы Jobin-Y von, термическую устойчивость исходного и модифицированных дуплексов определяли методом ДСК с помощью дифференциального адиабатического сканирующего калориметр а SCAL-1 фирмы «SCAL, Ltd» (Пущино).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке представлены спектры КД-ком-плексов. Видно, что использованные соединения платины различным образом влияют на стр уктуру дуплекса и некотор ые из них (особенно цис-ДГАДП) при использованных молярных соотношениях приводят к денатурации дуплекса [10]. В таблице приведены термодинамические характеристики дуплекса поли(А)-по-ли(У) и его комплексов с соединениями Pt(II). Очевидна полная корреляция между степенью нарушения вторичной структуры поли(А)-по-ли(У), р егистр ир уемого по спектрам КД, и изменением темпер атуры его плавления. Важно, что спектры КД позволяют сегрегировать повреждающее структуру дуплекса действие соединений платины от неповреждающего (или минимально повреждающего), а метод ДСК можно использовать уже лишь для наиболее интересных препаратов, так как он дает важную дополнительную информацию и может на фоне минимальных изменений в спектр ах КД выявить соединения, стабилизирующие структуру дуплекса (т.е. повышающие температуру плавления дуплекса). Таким обр азом, доказана принципиальная возможность направленного воздействия на стр уктуру дуплекса поли(А)-по-ли(У) и пр едставлена методология изучения последствий такого воздействия. Применение предложенной методологии позволит осуществить подбор оптимального модификатора и ввести дуплекс поли(А )-поли(У) в число наиболее активных индукторов интерферона.
Работа выполнена при финансовой поддержке научных программ Санкт-Петербургского научного центра РАН 2005 и 2006 гг. (тема 093) и гранта Президиума РАН по молекулярной и клеточной биологии.
742 БОГДАНОВ и др.
Термодинамические характеристики дуплекса поли(А)-поли(У) и его комплексов c соединениями Pt(II)
Шифр пробы Концентрация по-ли(А)-по-ли(У) в пробе, М Соединение платины Молярное отношение Pt/полинук-леотид Степень дестабилизации по спектрам КД Энтальпия AH, кДж/моль Температура плавления Т °С 1 пл' ^ Полушир и-на перехода Т1/2, °С
АУ0 2,03-10-3 - 0,00 - 11,95 54,0 1,7
АУ1 1,97-10-3 цие-ДДП 0,05 ++ 10,76 51,5 3,1
АУ2 0,6110-3 К 01 0,03 - 12,00 54,7 1,9
АУ3 1,38-10-3 К 02 0,05 ± 11,66 53,6 2,0
АУ4 1,89-10-3 К 03 0,10 + 11,32 52,3 3,2
АУ5 2,23-10-3 циоДГАДП 0,05 +++ 9,48 51,4 4,6
Примечание. К01 - ^иодиамминцитозинмонохлор-Р^П), К02 - mpанc-диамминцитозинмоноxлоp-Pt(II), К03 - ци^ди-амминдезокcицитидинмоноxлоp-Pt(II).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. E. De Cleixq, Тор1с8 in Current Chemistry 52, 173 (1974).
2. Л. М. Вильнер, А. Л. Тимковский и Н. С. Тихомирова-Сидор ова, Итоги науки и техники. Сер. Вирусология 6, 114 (1977).
3. А. Л. Тимковский, в кн. Индуктоpы uнтеpфеpона, Ред. Р. А. Кукайн (Зинатне, Рига, 1981), с. 52-65.
4. А. Л. Тимковский, Вестн. СПбГУ. Сер. 4, вып. 1, 21 (2007).
5. V. Brabec and A. L. Timkovskii, General Physiol. Bi-ophys. 2 (6), 487 (1983).
6. А. Л. Тимковский, З. Балцарова и В. Б р абец, Мо-лекуляр. биология 28 (5), 1028 (1994).
7. О. А. Аксенов, Г. А. Платонова и А. Л. Тимковский, Антибиотики и химиотерапия 44 (6), 12 (1999).
8. A. Т. M. Ma^elis, J. H. J. Den Hartog, G. A. Van der Marel, et al., Eur. J. Biodiem. 135, 343 (1983).
9. T. W. Hambley, ^ordination dem. Rev. 199, 181 (1977).
10. D. M. Gray, I. Tino^, and M. ^amberlm, B^o-lymers 11, 1235 (1972).
flЕCТАEH.ПH3АЦH£ H CТАEH.ПH3АЦH£ CTPYKTYPBI
743
Destabilization and Stabilization of poly(A)poly(U) Structure
by Platinum(II) Compounds
A. A. Bogdanov*, Yu.V. Ivanov**, N.A. Kasyanenko*, S.A. Potekhin***, M.A. Surzhik**, A.L. Timkovskii**, S.A. Feofanov****, R.S. Khusainova*****, and K.I. Yakovlev******
*St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russia
**Konstantinov Petersburg Institute of Nuclear Physics, Russian Academy of Sciences, Gatchina, Leningrad Region,
Russia
***Institute of Protein Researsh, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia
****Shemyakin and Ovchinnikov Institute ofBioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,
Pushchino, Moscow Region, 142290Russia
*****Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.