БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1025-1032
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
ДЕСТАБИЛИЗАЦИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ И ГИБЕЛЬ КАРДИОМИОЦИТОВ В ПРИСУТСТВИИ ПРОИЗВОДНЫХ ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
© 2008 г. А.В. Бережное, Е.И. Федотова, М.Н. Ненов*, Ю.М. Кокоз*,
В.П. Зинченко, В.В. Дынник*
Институт биофизики клетки РАН,142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; *Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Институтская, 3
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Методом флуоресцентной микроскопии на культуре изолированных кардиомиоцитов показано, что наибольшим эффектом при токсическом действии жирных кислот обладают производные длинноцепочечных кислот - миристоилкарнитин и пальмитоилкарнитин, которые в концентрациях 20 - 50 мкМ вызывают быстрое увеличение концентрации кальция в цитозоле ([Са ]{) и ги+бель клеток после лаг-периода, равного 4 - 8 мин. Эффек^+слабо зависит от содержания Са во внеклеточной среде или от введения ингибитора Са -каналов Ь-типа. Свободные жирные кислоты - пальмитиновая и миристиновая - в концентрациях 300 - 500 мкМ не вызывают такого сильного увеличения [Са ] в течение 30 мин и более. Наблюдаемый эффект объясняется активацией Са -каналов саркоплазматического ретикулума в присутствии ацил-карнитинов и/или образующихся ацил-КоА. Митохондрии в этих условиях играют роль Са -буферног^+системы. Емкость этого буфера определяет длительность лаг-периода. При увеличении Са2+-буферной емкости митохондрий при изменении концентрации неорганического фосфата увеличивается лаг-период. П2р+и ингибировании энергетики митохондрий в присутствии ротенона и олигомицина рост [Са ] при действии миристоил- и пальмитоилкарнитина происходит без лаг-периода. Исчерпание кальциевой емкости митохондрий или возможное падение митохондриального потенциала приводят к выбросу Са2+ из митохондрий и гибели клеток. Таким образом, первичной причиной токсического действия длинноцепочечных жирных кислот миристоилкарнитина и пальмитоилкарнитина является активация кальциевых каналов саркоплазматического ретикулума.
Ключевые слова: кардиомиоциты, Са2+, жирные кислоты, миристоилкарнитин, пальмитоилкарнитин, рианодиновый рецептор, митохондрия, Са -емкость митохондрий.
К числу наиболее токсичных жирных кислот (ЖК) относятся насыщенные - миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С 16:0) и ненасыщенные - олеиновая (С 18:1), арахидоновая (С20:4) кислоты. Хроническое увеличение уровня этих ЖК в крови является одним из основных факторов риска развития ожирения, диабета второго типа и ряда сердечно-сосудистых заболеваний [1,2]. В остром варианте при переходе от ишемии пораженного участка к его репер-фузии при инфаркте и инсульте резкое избыточное накопление жирных кислот и их ацил-КоА и ацилкарнитинов рассматривается как
Сокращения: ЖК - жирные кислоты, МПП - митохонд-риальная проницаемая пора, МС - миристоилкарнитин, РС - пальмитоилкарнитин, ЯуЯ - рианодиновые каналы, 1РзЯ - 1Рз-чувствительные каналы, СР - саркоплазмати-ческий ретикулум, 8ЕЯСЛ - Са2+-АТФ аза саркоплазма-тического ретикулума, РМСА - Са2+-АТФаза плазматической мемибраны.
один из главных механизмов поражения клеток сердца и мозга [3-7].
Хорошо известны протонофорные эффекты жирных кислот и их способность стимулировать формирование митохондриальной проницаемой поры (МПП) [8-10]. Накопление Са2+ в митохондриях в присутствии жирных кислот, с последующей деполяризацией митохондрий и возникновением МПП, рассматривается как основной механизм дисфункции митохондрий, обуславливающий гибель клеток вследствие некроза или апоптоза [10-14].
Ранее в экспериментах на изолированных митохондриях клеток разных типов нами было показано, что миристоилкарнитин (МС) и паль-митоилкарнитин (РС) в концентрациях 20 - 50 мкМ способны вызывать полное необратимое подавление дыхания митохондрий, падение ми-тохондриального потенциала А^ и окисление НАДИ. Свободные жирные кислоты с длиной углеродной цепи С6-С16 и ацилкарнитины с
1.00.8
^ 0.6-о з
Е 0.40.2- МА
' 1 0 0 - алчл^лиавоцэ^
Ионо
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Время, мин
Рис. 1. Влияние 500 мкМ миристиновой кислоты (МА) на уровень [Са2+] в кардиомиоцитах в присутствии 0,2% бычьего сы1вороточного альбумина в среде инкубации клеток. Наблюдается отсутствие (1) или медленный рост (2) [Са2+] в течение 30 мин. Нормировано на максимальный сигнал после добавления 1 мкМ иономицина (Ионо): 1 - среднее из шести клеток; 2 - среднее из двух клеток в эксперименте.
длиной углеродной цепи С6-С12 такими свойствами не обладали [15].
Помимо митохондриальных ферментов мишенью производных длинноцепочечных жирных кислот являются почти все Са2+-транспор-тирующие системы клетки. Показано, что ацил-карнитины длинноцепочечных жирных кислот могут ингибировать [16] или непосредственно активировать [17-19] Са2+-каналы плазмалем-мы. Ацил-КоА или их комплексы с буферным белком АСВР, а также ацилкарнитины способны активировать Са2+-каналы саркоэндоплаз-матического ретикулума: рианодиновые каналы (ЯуЯ) [20-23] и ^-чувствительные каналы (1РзЯ) [24]. В зависимости от концентрации, ацилкарнитины могут стимулировать или подавлять активность Са2+-транспортирующих АТФаз [21,25].
Таким образом, в клетке имеется множество потенциальных мишеней, но не известна временная организация процессов и ключевые мишени при действии токсических доз жирных кислот и их производных.
В данной работе, измеряя уровень цито-зольного кальция методами флуоресцентной микроскопии, мы пытались оценить вклад отдельных Са2+-транспортирующих систем клетки и определить первичные мишени при токсическом действии миристоилкарнитина и пальми-то илкар нитина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Кардиомиоциты были получены из желудочков сердец линейных крыс породы Spraque
Dowley по методу, описанному ранее [26]. Суспензию клеток в сбалансированном солевом растворе Хенкса, содержащем 10 мМ HEPES (рН 7,36), наносили на 25-миллиметровые круглые покровные стекла, монтировали в специальную камеру для инвертированного микроскопа и оставляли на 30 мин для прикрепления клеток. Затем раствор заменяли на раствор Хенкса, содержащий 5 мкМ кальций-чувствительного зонда Fluo-4AM и 0,05% Р1игошс F-127, и помещали в термостат на 40 мин при 37°С. После этого клетки отмывали в растворе Хенкса в течение 10 мин и использовали в эксперименте.
Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции «Cell observer» на базе моторизованного инвертированного микроскопа Axiovert 200M, оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции Fluo-4 (максимумы поглощения/эмиссии - « 490/525) был установлен запирающий светофильтр BP 475/40, для регистрации флуоресценции -фильтр BP 530/50. Получали серии изображений первичной культуры кардиомиоцитов, с интервалом 5 с. Растворы, содержащие двукратную концентрацию вносимых реагентов, подавали в камеру микропипеткой в объеме, равном объему среды в камере до добавления. При этом в контрольных экспериментах показано равномерное и быстрое перемешивание растворов. Полученные серии 8-битных изображений анализировали с помощью программы ImageJ. На графиках изменения флуоресценции представлены как изменение AF/Fo во времени: здесь AF = F - Fo, где F - среднее значение яркости пикселей, заключенных в области выделения, соответствующей одной клетке на каждом из кадров серии, а FQ - исходный сигнал перед первой добавкой. Также в экспериментах (рис. 1, 5) для нормировки использовался сигнал на добавление 1 мкМ кальциевого ионофора ио-номицина. На графиках представлены средние значения сигналов от нескольких клеток (как правило - 4 - 10 клеток) в поле зрения объектива. Эксперименты проводили не менее чем в трех повторах. В экспериментах с добавлением свободных жирных кислот, среда содержала 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Для получения среды с низкой концентрацией кальция (« 10-7 М при рН 7,36) к раствору Хенкса добавляли 2 мМ EGTA.
Использованные в работе иономицин, тап-сигаргин, пальмитоил-Ь-карнитин, миристоил-DL-карнитин, DL-гексаноилкарнитин, октано-илкарнитин, деканоилкарнитин, лауроилкарни-тин, пальмитиновая кислота, миристиновая кислота, рутениевый красный были получены из фирмы Sigma (CfflA), Fluo-4AM - из фирмы
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Время, с
(б)
Юс 500 с
» 700 с Ф 710с
Рис. 2. (а) - Влияние 50 мкМ мириетоилкарнитина (МС) на уровень [Са2+] в кардиомиоцитах. После лаг-периода в 4-8 мин наблюдается быстрый роет [Са2+]; и последующее уменьшение флуоресценции Fluo-4; (б) - последовательные изображения кар-диомиоцита из серии до (10 с после начала эксперимента) и после (500, 650, 700, 710 и 800 с) добавления 50 мкМ МС (добавка на 100 с). Видно, что после увеличения уровня цитозольного кальция на 650-й секунде происходит сокращение клетки. На изображениях 700 и 710 с от начала эксперимента видно, что флуоресцентный зонд выходит во внеклеточный раствор, что приводит к падению интенсивности флуоресценции.
Мо1еси1аг ргоЬез (США), солевой раствор Хен-кса - ПанЭко (Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В экспериментах на переживающей культуре кардиомиоцитов крысы показано, что введение в среду инкубации клеток свободных жирных кислот (миристиновой или пальмитиновой), в концентрациях до 500 мкМ, редко приводило к заметному увеличению уровня цитозольного кальция ([Са2+]^ на протяжении 30 мин и более (рис. 1). Однако добавление карнитиновых производных жирных кислот (МС или РС) в концентрациях 20 - 50 мкМ к кардиомиоцитам вызывало после лаг-периода высокоамплитудное увеличение [Са2+] с последующим уменьшением флуоресценции Б1ио-4 (рис. 2а). Этот эффект сопровождается нарушением проницаемости саркоплазматической мембраны, о чем
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Время, с
Рис. 3. Изменение [Са2+] при действии 50 мкМ МС в присутствии 1 мкМ блокатора кальциевого канала Ь-типа нифедипина (Ниф) (/) и в контроле (2).
свидетельствует выход флуоресцентного зонда во внеклеточный раствор после увеличения [Са2+] и сокращения кардиомиоцитов (рис. 2б). На протяжении лаг-периода не наблюдается заметного увеличения [Са2+^. Продо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.