ДЕФЕНСИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА Умнякова Е. С., Берлов М. Н., Кокряков В. Н.1,2
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН; 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Антимикробные пептиды (АМП) являются важными молекулярными факторами врожденного иммунитета, которые проявляют не только антимикробную активность, но и разнообразные иммуномодулирующие свойства. В нашей работе мы исследовали влияние ряда АМП человека (а-дефенсина HNP-1, ß-дефенсина HBD-2 и кателицидина LL-37) на активацию системы комплемента. Мы показали, что в концентрации 10 мкг/ мл HNP-1 и HBD-2 активируют комплемент, в то время как пептид LL-37 не оказывает влияния. Активность комплемента оценивали по степени увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны бактерии E. coli в результате формирования мембран-атакующего комплекса. Также мы обнаружили, что исследованные дефенсины человека и кателицидин свиньи PG-1 образуют комплексы с молекулой C1q, стабильные в присутствии 0,5 M NaCl, а LL-37 не взаимодействует с этим белком. Можно предположить, что дефенсины способны выполнять функцию эндогенных физиологических регуляторов системы комплемента. Возможно, эта регуляция осуществляется в результате их взаимодействия пептидов с белком C1q.
Ключевые слова: антимикробные пептиды, дефенсины, кателицидины, система комплемента, C1q
Антимикробные пептиды (АМП), экспрес-сируемые фагоцитами крови и эпителиальными клетками животных, являются важными молекулярными факторами врожденного иммунитета, и отвечают за инактивацию патогенных бактерий, грибов, вирусов и простейших паразитов, попадающих в организм хозяина. К числу наиболее важных групп АМП млекопитающих относятся дефенси-ны и кателицидины. Дефенсины млекопитающих включают 3 семейства пептидов (а-, в- и 0-дефенсины), обладающие признаками структурного сходства, такими как наличие в молекуле трех дисульфидных связей, доминирование в-структурных элементов, гомология по первичной структуре. Семейство кателицидинов объединяет несколько групп структурно неродственных пептидов, которые, однако, характеризуются наличием консервативного кателинового домена в составе молекул-предшественниц, удаляемого в ходе посттрансляционного процессинга. В организме человека содержатся а-дефенсины и кателицидин LL-37, локализованные преимущественно в гранулярном аппарате нейтрофилов, а также в-дефенсины, экспрессируемые эпителиальными клетками [1-5].
Согласно современным представлениям, функции АМП не ограничиваются антимикробной активностью, которая в физиологических условиях проявляется при довольно высоких концентрациях пептидов, редко достигаемых вне фаголизосом нейтрофилов. И при более низких концентрациях АМП остаются биологически активными молекулами, и проявляют, в частности, иммуномо-дулирующие свойства. Для различных АМП показаны липополисахарид-нейтрализующая и хемотаксическая активности, способность стимулировать продукцию цитокинов и хемо-кинов клетками иммунной системы, ангиоге-нез, ранозаживление [6-8].
АМП присущи всем изученным многоклеточным животным и представляют собой эво-люционно наиболее древнюю систему защиты многоклеточных организмов от инфекции. Другой ключевой системой защиты животных является система комплемента, первые компоненты которой появились в ходе эволюции уже у беспозвоночных (иглокожие, ас-цидии) [9-11]. Можно ожидать, что результатом длительной сопряженной эволюции АМП и системы комплемента стало возникновение механизмов их взаимодействия и взаи-
мовлияния. Однако до настоящего времени известно совсем немного работ на эту тему, а их данные в некоторой степени противоречивы. Так, например, показано, что дефенси-ны, взаимодействуя с рецепторной молекулой классического пути C1q, активируют систему комплемента [12]. В то же время, в других работах утверждается, что взаимодействие де-фенсинов с C1q или с маннозо-связывающим лектином, напротив, приводит к ингибирова-нию комплемента [13-15]. По другим данным, дефенсин человека HNP-1 и кателицидин свиньи протегрин PG-1 не взаимодействуют с C1q, но способны связываться с комплексом, включающим другие белки, входящие в состав C1 компонента комплемента: протеиназы C1s и C1r и их ингибитор C1i [16].
Целями данной работы стали изучение влияния ряда АМП человека на активацию комплемента, а также изучение взаимодействия АМП с белком C1q. Были исследованы представители основных групп антимикробных пептидов человека - а-дефенсинов (HNP-1), ß-дефенси-нов (HBD-2) и кателицидинов (LL-37). Для HNP-1 и HBD-2 имеются литературные данные о взаимодействии этих пептидов с C1q [12-15], а в отношении кателицидина LL-37 этот вопрос ранее не изучался.
Активность комплемента оценивали по увеличению проницаемости цитоплазмати-ческой мембраны бактерии Escherichia coli, штамм ML-35p [17-18]. В результате активации комплемента и формирования мембран-атакующего комплекса экзогенный субстрат орто-нитрофенил-Р^-галактозид (ONPG) проникает в цитоплазму клетки и гидроли-зуется ß-галактозидазой; интенсивность протекания этой реакции контролируется спек-трофотометрически (X = 492 нм). В качестве источника комплемента использовалась пули-рованная сыворотка крови здоровых доноров в концентрации 5%. Для контрольных проб сыворотку инактивировали прогреванием при +56 °C в течение часа. В условиях наших экспериментов в отсутствии пептидов примерно за 3 часа осуществлялся гидролиз половины количества ONPG, присутствовавшего в пробе. При добавлении HNP-1 или HBD-2 в концентрации 10 мкг/мл тот же результат достигался примерно на 30 мин быстрее, что свидетельствует об активирующем действии дефенсинов на систему комплемента, а кателицидин LL-37 не оказывал влияния.
Поскольку, согласно литературным данным, регуляторное влияние дефенсинов на систему комплемента осуществляется за счет их взаимодействия с С^, мы исследовали способность АМП к формированию комплексов с этим белком. Помимо АМП человека, в этой серии опытов использовали также кателицидин свиньи протегрин-1 (PG-1), который впервые был описан сотрудниками нашей лаборатории [19]. Будучи кателицидинами, протегрины имеют некоторые черты сходства с дефенсинами как по первичной, так и по вторичной структуре, и можно предполагать, что ген протегрина возник в эволюции в результате рекомбинации дефенсинового и кателицидинового генов. В опытах по влиянию АМП на активность комплемента действие PG-1 не было оценено из-за высокой собственной мембранолити-ческой активности этого пептида, сохраняющейся в присутствии 5%-ной сыворотки.
Для изучения взаимодействия АМП с С^ пептиды сорбировали в лунках планшета для иммуноферментного анализа. Для выявления комплексов использовали пероксидазную метку. Опыты проводили в двух вариантах: в первом пероксидазу из корней хрена конъюгиро-вали периодатным методом непосредственно с С^, во втором использовали поликлональ-ные антитела кролика к субъединице С белка С^ и вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой. Как известно, молекула СЦ представляет собой белковый комплекс из 6 олигомеров, в состав которых входят 3 полипептидные цепи (субъединицы): А, В и С [6].
По результатам опытов с конъюгатом С^ с пероксидазой хрена мы подтвердили литературные данные о взаимодействии пептидов НОТ-1 и НВБ-2 с СЦ. Также мы впервые показали взаимодействие PG-1 с С^ и установили, что LL-37 с этим белком не взаимодействует. Выявленные комплексы не разобщались в присутствии 0,5 М №С1. Опыты с антителами подтвердили формирование комплекса PG-1 с С^, стабильного в присутствии 0,5 М №С1, однако взаимодействие дефенсинов НОТ-1 и НВБ-2, так же как и кателицидина КЬ-37, с белком С^ в этом варианте метода не выявляется. Такие результаты можно объяснить тем, что ключевую роль в образовании комплексов СЦ с НОТ-1 и НВБ-2 человека играет субъединица С или общие для разных субъединиц антигенные детерминанты. До-
бавление поликлональных антител к субъединице С может приводить к разобщению комплексов. Для связывания C1q c PG-1 субъединица С, вероятно, не столь важна.
Стоит отметить, что и дефенсины и проте-грин PG-1 - это пептиды с доминированием ß-структуры, стабилизированные дисульфид-ными связями. Не исключено, что именно эти структурные особенности определяют возможность формирования комплекса с C1q, поскольку LL-37, а-спиральный пептид, не содержащий дисульфидных связей, не взаимодействует с C1q по данным нашей работы.
По результатам нашей работы можно предположить, что свое регуляторное действие на комплемент дефенсины осуществляют через формирование комплекса с белком C1q, модифицируя при этом его функциональные свойства. Хотя это предположение и остается недоказанным, косвенным его подтверждением может служить то обстоятельство, что пептид LL-37, не взаимодействующий с C1q, не оказывает влияния и на активность системы комплемента в целом.
Следует еще раз подчеркнуть, что в научной литературе имеются данные как об активации, так и об ингибировании комплемента дефенсинами. В работе, показавшей активирующее действие дефенсинов, в экспериментальной системе отсутствовал дополнительный активатор комплемента, и, по мнению авторов, сами дефенсины, взаимодействуя с глобулярными C-концевыми доменами субъединиц C1q, запускали каскад активации [12]. В работах, показавших ингибирующее действие дефенсинов на комплемент, активатором и мишенью действия комплемента были сенсибилизированные антителами эритроциты. По данным авторов, взаимодействие дефенсинов с C1q проходило с участием его коллагено-подобного домена [13-15]. В нашей экспериментальной модели вместо эритроцитов использовались бактериальные клетки E. coli, что, на наш взгляд, больше соответствует функциональной роли системы комплемента. Сопоставляя собственные данные с литературными, мы можем предположить, что дефен-сины повышают избирательность действия комплемента, активируя его в отношении бактериальных клеток и ингибируя в отношении эритроцитов. Возможно, такая избирательность достигается за счет известной из литературы избирательной сорбции дефенсинов
на поверхности бактериальных (а не эукари-отических) клеток [1-5]. Н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.