научная статья по теме ДЕФЕНСИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА Биология

Текст научной статьи на тему «ДЕФЕНСИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА»

ДЕФЕНСИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА Умнякова Е. С., Берлов М. Н., Кокряков В. Н.1,2

НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН; 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Антимикробные пептиды (АМП) являются важными молекулярными факторами врожденного иммунитета, которые проявляют не только антимикробную активность, но и разнообразные иммуномодулирующие свойства. В нашей работе мы исследовали влияние ряда АМП человека (а-дефенсина HNP-1, ß-дефенсина HBD-2 и кателицидина LL-37) на активацию системы комплемента. Мы показали, что в концентрации 10 мкг/ мл HNP-1 и HBD-2 активируют комплемент, в то время как пептид LL-37 не оказывает влияния. Активность комплемента оценивали по степени увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны бактерии E. coli в результате формирования мембран-атакующего комплекса. Также мы обнаружили, что исследованные дефенсины человека и кателицидин свиньи PG-1 образуют комплексы с молекулой C1q, стабильные в присутствии 0,5 M NaCl, а LL-37 не взаимодействует с этим белком. Можно предположить, что дефенсины способны выполнять функцию эндогенных физиологических регуляторов системы комплемента. Возможно, эта регуляция осуществляется в результате их взаимодействия пептидов с белком C1q.

Ключевые слова: антимикробные пептиды, дефенсины, кателицидины, система комплемента, C1q

Антимикробные пептиды (АМП), экспрес-сируемые фагоцитами крови и эпителиальными клетками животных, являются важными молекулярными факторами врожденного иммунитета, и отвечают за инактивацию патогенных бактерий, грибов, вирусов и простейших паразитов, попадающих в организм хозяина. К числу наиболее важных групп АМП млекопитающих относятся дефенси-ны и кателицидины. Дефенсины млекопитающих включают 3 семейства пептидов (а-, в- и 0-дефенсины), обладающие признаками структурного сходства, такими как наличие в молекуле трех дисульфидных связей, доминирование в-структурных элементов, гомология по первичной структуре. Семейство кателицидинов объединяет несколько групп структурно неродственных пептидов, которые, однако, характеризуются наличием консервативного кателинового домена в составе молекул-предшественниц, удаляемого в ходе посттрансляционного процессинга. В организме человека содержатся а-дефенсины и кателицидин LL-37, локализованные преимущественно в гранулярном аппарате нейтрофилов, а также в-дефенсины, экспрессируемые эпителиальными клетками [1-5].

Согласно современным представлениям, функции АМП не ограничиваются антимикробной активностью, которая в физиологических условиях проявляется при довольно высоких концентрациях пептидов, редко достигаемых вне фаголизосом нейтрофилов. И при более низких концентрациях АМП остаются биологически активными молекулами, и проявляют, в частности, иммуномо-дулирующие свойства. Для различных АМП показаны липополисахарид-нейтрализующая и хемотаксическая активности, способность стимулировать продукцию цитокинов и хемо-кинов клетками иммунной системы, ангиоге-нез, ранозаживление [6-8].

АМП присущи всем изученным многоклеточным животным и представляют собой эво-люционно наиболее древнюю систему защиты многоклеточных организмов от инфекции. Другой ключевой системой защиты животных является система комплемента, первые компоненты которой появились в ходе эволюции уже у беспозвоночных (иглокожие, ас-цидии) [9-11]. Можно ожидать, что результатом длительной сопряженной эволюции АМП и системы комплемента стало возникновение механизмов их взаимодействия и взаи-

мовлияния. Однако до настоящего времени известно совсем немного работ на эту тему, а их данные в некоторой степени противоречивы. Так, например, показано, что дефенси-ны, взаимодействуя с рецепторной молекулой классического пути C1q, активируют систему комплемента [12]. В то же время, в других работах утверждается, что взаимодействие де-фенсинов с C1q или с маннозо-связывающим лектином, напротив, приводит к ингибирова-нию комплемента [13-15]. По другим данным, дефенсин человека HNP-1 и кателицидин свиньи протегрин PG-1 не взаимодействуют с C1q, но способны связываться с комплексом, включающим другие белки, входящие в состав C1 компонента комплемента: протеиназы C1s и C1r и их ингибитор C1i [16].

Целями данной работы стали изучение влияния ряда АМП человека на активацию комплемента, а также изучение взаимодействия АМП с белком C1q. Были исследованы представители основных групп антимикробных пептидов человека - а-дефенсинов (HNP-1), ß-дефенси-нов (HBD-2) и кателицидинов (LL-37). Для HNP-1 и HBD-2 имеются литературные данные о взаимодействии этих пептидов с C1q [12-15], а в отношении кателицидина LL-37 этот вопрос ранее не изучался.

Активность комплемента оценивали по увеличению проницаемости цитоплазмати-ческой мембраны бактерии Escherichia coli, штамм ML-35p [17-18]. В результате активации комплемента и формирования мембран-атакующего комплекса экзогенный субстрат орто-нитрофенил-Р^-галактозид (ONPG) проникает в цитоплазму клетки и гидроли-зуется ß-галактозидазой; интенсивность протекания этой реакции контролируется спек-трофотометрически (X = 492 нм). В качестве источника комплемента использовалась пули-рованная сыворотка крови здоровых доноров в концентрации 5%. Для контрольных проб сыворотку инактивировали прогреванием при +56 °C в течение часа. В условиях наших экспериментов в отсутствии пептидов примерно за 3 часа осуществлялся гидролиз половины количества ONPG, присутствовавшего в пробе. При добавлении HNP-1 или HBD-2 в концентрации 10 мкг/мл тот же результат достигался примерно на 30 мин быстрее, что свидетельствует об активирующем действии дефенсинов на систему комплемента, а кателицидин LL-37 не оказывал влияния.

Поскольку, согласно литературным данным, регуляторное влияние дефенсинов на систему комплемента осуществляется за счет их взаимодействия с С^, мы исследовали способность АМП к формированию комплексов с этим белком. Помимо АМП человека, в этой серии опытов использовали также кателицидин свиньи протегрин-1 (PG-1), который впервые был описан сотрудниками нашей лаборатории [19]. Будучи кателицидинами, протегрины имеют некоторые черты сходства с дефенсинами как по первичной, так и по вторичной структуре, и можно предполагать, что ген протегрина возник в эволюции в результате рекомбинации дефенсинового и кателицидинового генов. В опытах по влиянию АМП на активность комплемента действие PG-1 не было оценено из-за высокой собственной мембранолити-ческой активности этого пептида, сохраняющейся в присутствии 5%-ной сыворотки.

Для изучения взаимодействия АМП с С^ пептиды сорбировали в лунках планшета для иммуноферментного анализа. Для выявления комплексов использовали пероксидазную метку. Опыты проводили в двух вариантах: в первом пероксидазу из корней хрена конъюгиро-вали периодатным методом непосредственно с С^, во втором использовали поликлональ-ные антитела кролика к субъединице С белка С^ и вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой. Как известно, молекула СЦ представляет собой белковый комплекс из 6 олигомеров, в состав которых входят 3 полипептидные цепи (субъединицы): А, В и С [6].

По результатам опытов с конъюгатом С^ с пероксидазой хрена мы подтвердили литературные данные о взаимодействии пептидов НОТ-1 и НВБ-2 с СЦ. Также мы впервые показали взаимодействие PG-1 с С^ и установили, что LL-37 с этим белком не взаимодействует. Выявленные комплексы не разобщались в присутствии 0,5 М №С1. Опыты с антителами подтвердили формирование комплекса PG-1 с С^, стабильного в присутствии 0,5 М №С1, однако взаимодействие дефенсинов НОТ-1 и НВБ-2, так же как и кателицидина КЬ-37, с белком С^ в этом варианте метода не выявляется. Такие результаты можно объяснить тем, что ключевую роль в образовании комплексов СЦ с НОТ-1 и НВБ-2 человека играет субъединица С или общие для разных субъединиц антигенные детерминанты. До-

бавление поликлональных антител к субъединице С может приводить к разобщению комплексов. Для связывания C1q c PG-1 субъединица С, вероятно, не столь важна.

Стоит отметить, что и дефенсины и проте-грин PG-1 - это пептиды с доминированием ß-структуры, стабилизированные дисульфид-ными связями. Не исключено, что именно эти структурные особенности определяют возможность формирования комплекса с C1q, поскольку LL-37, а-спиральный пептид, не содержащий дисульфидных связей, не взаимодействует с C1q по данным нашей работы.

По результатам нашей работы можно предположить, что свое регуляторное действие на комплемент дефенсины осуществляют через формирование комплекса с белком C1q, модифицируя при этом его функциональные свойства. Хотя это предположение и остается недоказанным, косвенным его подтверждением может служить то обстоятельство, что пептид LL-37, не взаимодействующий с C1q, не оказывает влияния и на активность системы комплемента в целом.

Следует еще раз подчеркнуть, что в научной литературе имеются данные как об активации, так и об ингибировании комплемента дефенсинами. В работе, показавшей активирующее действие дефенсинов, в экспериментальной системе отсутствовал дополнительный активатор комплемента, и, по мнению авторов, сами дефенсины, взаимодействуя с глобулярными C-концевыми доменами субъединиц C1q, запускали каскад активации [12]. В работах, показавших ингибирующее действие дефенсинов на комплемент, активатором и мишенью действия комплемента были сенсибилизированные антителами эритроциты. По данным авторов, взаимодействие дефенсинов с C1q проходило с участием его коллагено-подобного домена [13-15]. В нашей экспериментальной модели вместо эритроцитов использовались бактериальные клетки E. coli, что, на наш взгляд, больше соответствует функциональной роли системы комплемента. Сопоставляя собственные данные с литературными, мы можем предположить, что дефен-сины повышают избирательность действия комплемента, активируя его в отношении бактериальных клеток и ингибируя в отношении эритроцитов. Возможно, такая избирательность достигается за счет известной из литературы избирательной сорбции дефенсинов

на поверхности бактериальных (а не эукари-отических) клеток [1-5]. Н

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком