БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1008-1013
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.32/.36:57.085.23d
ДЕГЕНЕРАЦИЯ КОНУСОВ РОСТА В КУЛЬТУРЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ МЫШИ С НОКАУТОМ ГЕНА
ПРЕСЕНИЛИНА 1
© 2008 г. А.Л. Шварцман* **, C.B. Саранцева*, К.В. Соловьев**, О.Л. Рунова**,
Е.И. Талалаева**, М.П. Витек***
*
Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, 188300, Гатчина
Ленинградской области;
**
Институт экспериментальной медицины РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. И.П. Павлова, 12;
*** ^
Отдел неврологии, Медицинский центр УниверситетаДюка, Дурем, NC 27710, США Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Проведено сравнительное исследование морфологии конусов роста в культивируемых эмбриональных нейронах, полученных от мышей дикого типа PS1 (+/+) и мышей с нокаутом гена PS1(-/-). Конусы роста нейронов у мышей PS1(+/+) характеризовались выраженной адгезией на поверхности матрикса и присутствием значительных по размеру ламеллярных радиальных структур с множеством филоподий. Напротив, конусы роста нейронов у мышей PS1(-/-) характеризовались небольшими по размеру радиальными ламеллярными структурами, незначительной адгезией на матриксе, отсутствием филоподий. Через три - четыре дня роста нейронов значительная часть конусов роста PS1(-/-) нейронов подвергалась спонтанной дегенерации. Мы предполагаем, что аномалии конусов роста нейронов у мышей PS1(-/-) отражают изменения целостности цитоскелета, приводящие к нарушению процессов миграции нейронов, становления нейронных сетей и синаптогенеза.
Ключевые слова: первичные нейроны, пресенилин 1, нокаут гена пресенилина 1, ламелиподиум, растущий конус, болезнь Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера представляет собой одно из самых распространенных нейр о дегенеративных заболеваний, которое характеризуется прогрессирующей потерей памяти, распадом интеллекта и неизбежным летальным исходом [1]. Подавляющее большинство случаев ранней семейной формы болезни Альцгеймера вызвано мутациями в гене пресенилина 1 (РБ1) [2-4]. В то же время клеточные функции пресенилина 1 (РБ1) остаются не вполне понятными. С одной стороны, не вызывает сомнений тот факт, что РБ1 является частью у-секретазного комплекса, который играет ключевую роль в генерации амилоид-Р-протеина (АР), основного компонента амилоидных отложений в мозге людей, страдающих болезнью Альцгеймера [3]. С другой стороны, совершенно неясно, определяет ли именно АР ранние нарушения памяти и синап-тической пластичности при семейных формах болезни Альцгеймера или эти процессы связаны с нарушением клеточных функций РБ1. Действительно, трансгенные мыши с полным выклю-
Сокращения: PS1 - пресенилин 1, Лр - амилоид-Р-протеин, КР - конус роста.
чением экспрессии генов пресенилинов PS1 и PS2 в переднем мозге («conditional double knockout mice») в постнатальный период характеризуются потерей памяти, нарушением синап-тической пластичности и развитием нейродеге-неративных процессов, т.е. классической картиной раннего нейропатологического процесса болезни Альцгеймера в отсутствие генерации Ар [5,6]. Хотя исследования, проведенные на трансгенных животных, указывают на участие PS1 в дифференцировке нейронов в эмбриогенезе, роль PS1 в образовании синапсов и си-наптической пластичности остается не вполне понятной [4].
У мышей с нокаутом гена PS1 в эмбриогенезе наблюдали выраженные скелетные аномалии, кортикальную дисплазию, нарушение миграции нейронов и гибель клеток Кахаля-Ретциуса в маргинальной зоне коры мозга [7,8]. Хотя эти нарушения носили летальный характер, тем не менее эмбриональные нейроны могли быть культивированы и использованы для исследования. Анализ морфологии культивируемых нейронов показал повышенное ветвле-
ДЕГЕНЕРАЦИЯ КОНУСОВ РОСТА
Характеристика конусов роста РБ1(+/+) и Р51 (-/-) нейронов
1009
Конусы роста
Нейроны (x < 10 мкм2) (10 < x < 100 мкм2) (x > 100 мкм2) Дегенерация. Коллапс
PS1(+/+) 8 (9,7%) 31 (37,8%) 37 (45,1%) 6 (7,3%)
PS1 (-/-) 20 (22,7%) 17 (19,3%) 20 (22,7%) 31 (35,2%)
Примечание. Для сравнения параметров конусов роста исследовали по 60 нейронов, полученных от Р£1(+/+) и Р£7(-/-) культур; х - площадь конусов роста (расстояние от их «шейки» до границы филоподий).
ние аксонов, но без выраженного изменения длины или ветвления дендритов [9].
Здесь следует отметить, что образование аксонных ответвлений (арборизация аксонов) является критическим этапом в формировании нейронных сетей и, по всей видимости, отмеченные аномалии морфологии PS1(-/-) нейронов отражают процессы, приводящие в конечном счете к наблюдаемой дисфункции синапсов в постнатальный период при выключении генов PS1 и PS2 [5]. Одним из основных механизмов ветвления аксонов является удлинение его дис-тального конца и образование конусов роста (KP) в отростках ветвления, которые и определяют направление миграции нейронов [10]. Поэтому структура конусов роста может быть критическим показателем в миграции вновь образующихся нейронов в эмбриогенезе, становления нейронных сетей и образования синапсов.
Ранее мы показали, что в культурах эмбриональных нейронов, полученных от мышей дикого типа, PS1 концентрируется в центральном районе конусов роста и обнаруживается на поверхности ламеллиподий и филоподий конусов роста в контактирующих нейритах [11,12]. Вполне вероятно, что PS1 играет значительную роль в стабилизации структуры конусов роста, поскольку он связан с элементами цитоскелета, и изменение этого связывания влияет на рост нейритов в процессе дифференцировки [13]. В настоящей работе мы провели сравнительное исследование морфологии конусов роста в культивируемых эмбриональных нейронах, полученных от мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена PS1. Мы предполагаем, что анализ морфологии конусов роста представляет значительный интерес для понимания структурной роли PS1 в образовании конусов роста, функций PS1 в процессах миграции нейронов и синаптоге-неза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры. Получение первичных культур кортикальных нейронов мыши из 15-
16-дневных эмбрионов описано нами ранее [11]. Нейронные культуры мышей с нокаутом гена PS1 (-/-) были любезно предоставлены доктором Де Струпером и доктором Сафтигом (Dr. B. De 81гоорег and Dr. P. Saftig, Ехрепшеп1а1 Genetics Огоир, Center for Human Genetics, Cam-ри Gasthuisberg, Belgium). Плотность посева клеток в ячейках (диаметром 12 или 25 мм) на стеклах, покрытых поли^-лизином, составляла (1 - 2)104/см2. Эта плотность подбиралась экспериментально с таким условием, чтобы можно было выделить для микроскопического анализа единичный нейрон. Нейроны поддерживали на среде, содержащей DMEM и 10%-ю эмбриональную сыворотку теленка в среде с 5% CO^ Площадь конусов роста оценивали в программе ImageJ (Version 1.38 for Windows, Ы1р:// rsb.info.nih.gov/ij/). Для сравнения параметров конусов роста использовали по 60 нейронов, полученных из PS1 (+/+) и PS1 (-/-) культур.
Сканирующая электронная микроскопия. Культуры первичных нейронов мыши были зафиксированы в 2% параформальдегиде/0,1% глутаральдегиде. Каждый образец вновь промывали фосфатно-солевым буфером, и дополнительную фиксацию проводили в 2% пара-формальдегиде/1,5% глутар альдегиде в 0,1 М какодилате натрия при рН 7,4 в течение 1 ч, а затем обрабатывали в 1% тетроксиде осмия в течение 1 ч при 22°C. Последующие этапы приготовления образцов включали дегидратацию в смеси этанол/гексаметилдисилазан (1:1) в течение 30 мин, обработку в 100% гексаме-тилдисилазане в течение 2 ч при комнатной температуре. После полного выпаривания гек-саметилдисилазана образцы анализировали на сканирующем электронном микроскопе JSM-5300 (JeoL, Токио, Япония) при 10 кВ при установке детектора в положении 40 - 52°. Детальное описание метода сканирующей электронной микроскопии приведено нами в предыдущих исследованиях [11,12].
1010
ШВАРЦМАН и др.
Рис. 1. Р£7(+/+) нейроны; стрелками указаны выбранные для анализа конусы роста. Масштаб: 32,405 мкм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе Р£1(+/+) и Р£1 (-/-) нейронов методом сканирующей электронной микроскопии мы не отмечали каких-либо выраженных различий в форме клеток, или длине аксонов и нейритов (рис. 1, 2). Лишь для некоторых Р57(-/-) нейронов было замечено незначительное увеличение числа ответвлений, как для коротких нейритов, так и аксонов. Наибольшие различия при исследовании этих культур были отмечены для конусов роста (таблица). Р£1(+/+) характеризовались значительно более высокой долей конусов роста с размерами 10 < х <100 мкм2 и х >100 мкм2. Для Р£1 (-/-) нейронов,
Рис. 2. РБ1(-/-) нейроны. Стрелками указаны выбранные для анализа конусы роста. Масштаб: 32,405 мкм.
напротив, часто встречались конусы роста с размерами х < 10 мкм2.
Морфология конусов роста варьировала в зависимости от их размера (рис. 3). Как правило, конусы роста площадью х > 100 мкм2 характеризовались выраженной адгезией на поверхности матрикса и присутствием значительных по размеру ламеллярных радиальных структур с множеством длинных филоподий. Конусы роста площадью х < 10 мкм2 часто не имели какой-либо выраженной формы и представляли собой небольшие утолщения, не имеющие четких филоподий. В то же время на разветвленных нейритах обнаруживались сравнительно небольшие конусы роста, однако, имеющие значительное число филоподий.
Через три - четыре дня роста нейронов значительная часть конусов роста в Р£1(-/-)-
ДЕГЕНЕРАЦИЯ КОНУСОВ РОСТА
1011
ДО
Рис. 3. Конусы роста Р51(+ + ) нейронов. Масштаб: Рис- 4 Дегенерация конусов роста р^1(-/-) нейро-
1,856 мкм. нов. Масштаб: 4,861 мкм.
1012
ШBAPЦMAH и др.
культурах подвергалась спонтанной дегенерации, включающей как центральную зону, так и ламеллиподии и филоподии (рис. 4).
В целом наши результаты показывают, что РБ1 является одним из ключевых белков конусов роста и вовлечен в процессы формирования и роста нейритов. Эти данные могут играть важную роль в понимании роли РБ1 в синап-тогенезе. Действительно, хотя в настоящее время не остается сомнений в том, что РБ1 играет важную роль в дифференцировке нейронов, его функции в образовании нейронных сетей остаются недостаточно и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.