СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2012, том 2б, № 2, с. 150-159
_ ЗРИТЕЛЬНАЯ _
СИСТЕМA
УДК 577.354.2
ДЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ У ДРОЗОФИЛЫ: МУТАЦИЯ ГЕНА trp, КОДИРУЮЩЕГО СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ Ca^-КАНАЛ
© 2012 г. А. Д. Поляновский, Т. Р. Барбер1
Учреждение РАН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН,
194223 Санкт-Петербург, пр. Тореза 44, E-mail: apolyano@mail.ru 1Cambridge University, Department of Anatomy, Cambridge CB2 3DY, United Kingdom
Поступила в редакцию 03.06.2011 г.
Продукт гена trp - светочувствительный Са2+-канал TRP - является не только основным каналом фототока в фоторецепторах дрозофилы, но и прототипом огромного семейства канальных белков, играющих ключевую роль во всех фосфоинозитидных каскадах сигнальной трансдукции. Мутация trp приводит к дегенерации фоторецепторов, имеющей много общего, например, с гибелью кардиомиоцитов у человека. Для выяснения механизма этой дегенерации проведен сравнительный электронно-микроскопический анализ динамики морфологических изменений в сетчатке дрозофилы дикого типа, мутантов trp и norpA, а также двойных мутантов norpA;trp, trp;A356 и norpA;A356 в условиях непрерывного освещения белым или красным светом. Показано, что дегенерация сетчатки у мутанта trp предотвращается нокаутом гена norpA, кодирующего фосфолипазу С, но не предотвращается ни экспозицией при красном свете, ни элиминацией мест фосфорилирования родопсина (нокаут гена А356). Это позволяет предположить, что главной причиной апоптозной дегенерации сетчатки у мутанта trp является не гиперфосфорилирование родопсина и накопление стабильных комплексов метародопсин/аррестин (наиболее вероятный сценарий у мутанта norpA), а истощение внутриклеточного пула фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (гипотетического фактора выживания клетки) в результате прекращения входа в клетку ионов Са2+. Результаты исследования укрепляют репутацию фоторецепторов дрозофилы как удобной экспериментальной модели для изучения молекулярно-клеточных механизмов ряда патологий человека.
Ключевые слова: дегенерация сетчатки, фототрансдукция, trp, дрозофила.
ВВЕДЕНИЕ
В микровиллярных фоторецепторах беспозвоночных трансдукция света осуществляется при помощи фосфоинозитидного (GPCR) сигнального каскада (Hardie, Potsma, 2008). Мутация практически любого гена этого каскада приводит к дегенерации фоторецепторов. Не удивительно, что глаз дрозофилы является признанной модельной системой для изучения молекулярных механизмов как самой фосфоинозитидной сигнализации, широко распространенной в животном мире, так и патологических процессов в сетчатке. В связи с огромным интересом к проблеме гибели нервных клеток вообще и как причины многих заболеваний в частности идет интенсивный поиск гомоло-
гов генов дрозофилы у человека (Wang, Montell, 2007). Многочисленные свидетельства говорят о том, что заключительные этапы дистрофии сетчатки могут происходить по механизму апо-птоза (Kiselev et al., 2000). Однако о начальных пусковых механизмах этих процессов до сих пор известно чрезвычайно мало.
Фотоизомеризация родопсина у дрозофилы приводит через посредничество Gq-белка к активации фосфолипазы С (PLC), кодируемой геном no receptor potential A (norpA). Это в свою очередь вызывает гидролитическое расщепление конституционального мембранного фосфолипи-да, фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (PIP2), и образование двух мессенджеров - инозитол-трифосфата (InsP3) и диацилглицерола (DAG).
Кто из них приводит, в конце концов, к фотовозбуждению, является в настоящее время одним из спорных вопросов фоторецепции у беспозвоночных, однако заключительное событие каскада хорошо изучено: происходит активация двух светочувствительных каналов, кодируемых генами transient receptor potential (trp) и transient receptor potential-like (trpl), через которые в клетку входит деполяризующий фототок. Мутация гена trp приводит к быстрому угасанию рецепторного потенциала (Cosens, Manning, 1969). Дальнейшие исследования показали, что кодируемый этим геном трансмембранный белок TRP представляет собой Са2+-селективный канал, проводящий основную часть фототока (Hardie, Minke, 1992). Исключительная важность этого открытия для всей клеточной биологии сегодня уже совершенно очевидна: TRP-канал в фоторецепторах дрозофилы является прототипом огромного (и продолжающего расширяться) семейства ионных каналов, признанных центральными эффекторами всех GPCR-каскадов трансдукции (Montell, 2005). Следует отметить, что ультраструктурная локализация TRP-канала в фоторецепторах дрозофилы сыграла важную роль в понимании механизма его активации (Полянов-ский, 1998; Поляновский и др., 1999). К настоящему времени у млекопитающих обнаружено более двадцати изоформ TRP, относящихся по крайней мере к трем основным подклассам (TRPC, TRPM и TRPV) и выполняющих исключительно широкий диапазон функций - от восприятия вкусовых (сладкого и горького) стимулов и различения холодного и горячего до обеспечения нормальной работы кардиомиоцитов и поддержания сосудистого тонуса (Hardie, Raghu, 2001; Nishida et al., 2006; Nilius et al., 2007). Повсеместное обнаружение TRP-каналов в животном мире (и даже у дрожжей) позволяет смотреть на это семейство как на древнейший сенсорный аппарат клетки, ответственный за восприятие множества внутри-и внеклеточных сигналов (Clapham, 2003).
Еще в 1972 г. было показано, что у мутантов trp дрозофилы, лишенных TRP-каналов, происходит светозависимая дегенерация фоторецепторов сетчатки (Cosens, Perry, 1972). В то же время установлено, что гиперстимуляция TRP-каналов при помощи капсаицина вызывает смерть нейронов, во многом объясняющую анальгезирующий эффект этого вещества (Clapham, 2003). В наших исследованиях также было обнаружено, что гиперактивность TRP-каналов у мутантов retinal degeneration A (rdgA) вызывает летальную дегенерацию фоторецепторов сетчатки (Raghu et al., 2000). До сих пор непонятно, почему как гипо- (у мутан-
hv :
Родопсин фосфатаза
480 нм 570 нм
М*
Агг t
M,
рр
АТФ Родопсин АДф киназа
. Дд. ------^ «Клатриновый»
Агг,
R,
рр
АТФ
е570нм" Мрр-Аггр
эндоцитоз
I ( ■*" Кальмодулин
киназа
Рис. 1. Цикл зрительного пигмента (родопсина) в фоторецепторах дрозофилы. Я - родопсин, М* - активный метародопсин, Мрр - фосфорилированный метародопсин, Агг - аррестин, Аггр - фосфорилированный аррестин, Ярр -фосфорилированный родопсин, АТФ - аденозинтрифосфор-ная кислота, АДФ - аденозиндифосфорная кислота.
та trp), так и гиперактивность (у мутанта rdgA) TRP-каналов приводит к одному и тому же печальному финалу. Расшифровка молекулярного механизма этой патологии могла бы способствовать пониманию самых разнообразных форм дегенерации сетчатки при различных заболеваниях.
Существуют две основные гипотезы, пытающиеся объяснить механизм дегенерации сетчатки у мутантов trp. Одна из гипотез связывает дегенерацию с дефектом механизма регенерации родопсина, точнее - механизма завершения фотоответа (рис. 1). Под действием голубого света (480 нм) родопсин (R) изомеризуется в активный мета-родопсин (М*). Реизомеризация М* в исходный R требует прежде всего его инактивации путем фос-форилирования родопсинкиназой и связывания с аррестином (Arr), в результате чего образуется Mpp-Arr комплекс. Важно подчеркнуть, что именно этот комплекс является мишенью "клатрино-вого" эндоцитоза; однако в норме эндоцитоза не происходит поскольку этот процесс ингибируется фосфорилированием Arr в Arrp светозависимой Са2+/кальмодулинкиназой (CaMKII). Реизоме-ризация Mpp в Rpp под действием зеленого света (570 нм) ведет к освобождению Arrp, т.е. распаду Mpp-Arrp комплекса (Hardie, Postma, 2008). Как только метародопсин отделяется от аррестина он дефосфорилируется с помощью Са2+-зависимой родопсинфосфатазы и возвращается в исходное состояние (R). При различных вариантах нарушения светозависимого входа Са2+ фоторецепторы дрозофилы претерпевают дегенерацию, во многом сходную с дегенерацией сетчатки позвоночных. Так происходит, например, у мутанта retinal degeneration C (rdgC), лишенного Са2+-зависимой родопсинфосфатазы (Byk et al., 1993), и мутанта norpA, у которого отсутствует центральное звено каскада - PLC, а следовательно, и светозависимый
Gr,
Фоторецепторная мембрана
- PLC ^рп>2
погрА
InsP3
DAG—PUFAs
Na+
TRPL
3Na+
a+/Ca2+ [обменник
1Са2+
Рис. 2. Фототрансдукция в фоторецепторах дрозофилы. R - родопсин, M* - активный метародопсин, Gq - G-белок (q-субъ-единица), PLC - фосфолипаза С, кодируемая геном norpA, Р1Р2-фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, InsP3 - инозитолтри-фосфат, DAG - диацилглицерол, PUFAs - полиненасыщенные жирные кислоты, TRP - главный ионный канал фототока (Са2+-селективный), TRPL - дополнительный канал фототока.
вход Са2+ в клетку через TRP-каналы (Bloomquist et al., 1988). Предполагается, что в обоих случаях первой жертвой становится именно Са2+-зависи-мая родопсинфосфатаза, что неизбежно приводит к следующему каскаду событий: гиперфосфори-лированию родопсина, избыточному накоплению в цитоплазме Mpp-Arr комплексов, запуску "клат-ринового" эндоцитоза и, наконец, активации апо-птоза, приводящего клетку к гибели (Chinchore et al., 2008; Minke, 2002).
Таким образом, светозависимый вход Ca2+ необходим как для дефосфорилирования Мрр, так и для фосфорилирования Arr, и любое его ограничение гипотетически может привести к гибели клетки в результате нарушения цикла регенерации родопсина. Поскольку у мутанта trp светозависимый вход Са2+ в клетку отсутствует, первая гипотеза, требовавшая экспериментальной проверки в настоящей работе, состояла в том, что причиной дегенерации его сетчатки может быть гиперфосфорилирование родопсина и вызванное этим избыточное накопление стабильных Mpp-Arr комплексов. При этом следует учитывать, что ни для завершения фотоответа, ни для связывания аррестина фосфорилирования метародопсина не требуется, а значит, одного лишь гиперфосфори-лирования, даже если оно и необходимо, скорее всего для этого недостаточно. Ценным инструментом в решении этой задачи может быть мутация гена А356, приводящая к элиминации мест фосфорилирования родопсина на С-терминали. Показано, чт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.