ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 73, № 5, с. 389-395
УДК 632.937.16:632.654
ДЕМОНСТРАЦИЯ ОТДАЛЕННОГО ЭФФЕКТА
ВЕРТИКАЛЬНОЙ ПЕРЕДАЧИ БАКУЛОВИРУСА НА ПРИМЕРЕ НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА LYMANTRIA DISPAR L. (LEPIDOPTERA, LYMANTRIIDAE)
© 2012 г. А.В. Ильиных, О.В. Поленогова
Институт систематики и экологии животных СО РАН 630091 Новосибирск, ул. Фрунзе, 11 e-mail: ail@online.sinor.ru Поступила в редакцию 21.06.2011 г.
Впервые продемонстрировано, что вирусная инфекция может формироваться у насекомых, выживших после инфицирования непарного шелкопряда в фазе гусеницы вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), и вызывать смертность особей, как минимум, в течение двух генераций (период наблюдения). Передача вируса дочернему поколению происходит как самцами, так и самками насекомых, выживших после инфекции. С помощью метода ПЦР показано, что уровень вирусоносительства у непарного шелкопряда в поколениях F1 и F2 выше, чем количество погибших от полиэдроза насекомых.
Патогены и, в частности, вирусы играют важную роль в популяционной динамике (Kukan, 1999; Ilyinykh, 2011) и, возможно, в поддержании генетического полиморфизма своих хозяев (Antonovics, Thrall, 1994). Поэтому проблема, каким образом поддерживается перманентность вирусной инфекции в популяциях вирусоносителей и как инициируются заболевания при естественных эпизоотиях, относится к числу принципиальных проблем общей биологии.
Удобными объектами для исследования взаимоотношений в системе "вирус-хозяин" могут быть бакуловирусы и их хозяева - насекомые, поскольку бакуловирусы относительно видоспецифичны, а для ряда насекомых отработаны методы их культивирования в лабораторных условиях. Поэтому в литературе известны работы, посвященные исследованию вертикальной передачи бакуловиру-сов у некоторых видов насекомых (Young, 1990; Kukan, 1999; Myers et al., 2000; Fuxa et al., 2002; Khurad et al., 2004, и др.). Однако полученные результаты весьма противоречивы: так, смертность от вироза среди потомков насекомых, выживших в результате заражения родительского поколения, варьирует от 0% у Spodoptera ornitogalli (Young, 1990) до 100% у тутового шелкопряда Bombyx mori (Khurad et al., 2004). Кроме того, в большинстве случаев для диагностики патогена
авторы ограничивались микроскопией (световой и/ или электронной) без применения методов молекулярной биологии (Kukan, 1999). Наконец, известны лишь две работы, в которых исследовалась вертикальная передача вируса в череде генераций насекомых: Plodia interpunctella (Burden et al., 2002) и Spodoptera exigua (Cabodevilla et al., 2011), в других работах исследования ограничены первым дочерним поколением. Однако в этих статьях не приводятся данные по смертности насекомых в результате вертикальной передачи вируса, отмечается только количество насекомых-вирусоносителей.
В настоящей работе осуществлялось моделирование вертикальной передачи ВЯП у непарного шелкопряда и впервые исследовалось проявление спонтанного полиэдроза в течение двух генераций насекомого. Кроме того, с помощью метода ПЦР выполнялась диагностика скрытого вируса у насекомых до их инфицирования в лабораторных условиях, а также у особей, выживших после заражения вирусом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор яиц непарного шелкопряда осуществляли в очагах массового размножения на территории Новосибирской области в октябре 2005 г.
Собранные яйца хранили при температуре +2° C до начала экспериментов. Подготовку яиц и культивирование гусениц выполняли по методике, описанной ранее (Ilyinykh et al., 2004). Во время эксперимента гусениц содержали на ветвях березы Betula pendula. Это растение является одной из основных кормовых пород для гусениц непарного шелкопряда в Западной Сибири и Зауралье.
Для заражения гусениц вирусом из ручного опрыскивателя обрабатывали четыре стандартные ветви кормовых растений, равномерно распределенных на площадке из полиэтилена площадью 0.25 м2. Количество вирусной суспензии составляло 2.5 мл в каждом случае. Инфицирование проводили через 2 дня после линьки гусениц на четвертый возраст. В контрольной группе насекомых корм обрабатывали дистиллированной водой. После просушивания ветви кормовых растений помещали в 3-литровые сосуды с гусеницами непарного шелкопряда по 15 особей в каждом сосуде.
Количество насекомых на каждую концентрацию вируса и в контроле составило по 150 особей. Сосуды просматривали ежедневно и при необходимости заменяли корм и удаляли погибших особей, которых анализировали под световым микроскопом для диагностики причины гибели. Выживших насекомых выращивали до фазы имаго, скрещивали и от них получали потомство. Для исследования влияния половой принадлежности насекомых на уровень вертикальной передачи вируса скрещивали инфицированных самок с контрольными самцами, а контрольных самок -с инфицированными самцами. В обоих случаях использовали насекомых, выживших после заражения гусениц концентрацией 5 * 105 полиэдров на 1мл. Контролем служили неинфицированные насекомые.
Для оценки достоверности различий выборочных средних применяли критерий Стьюдента, используя угловое преобразование Фишера (Лакин, 1990).
В работе применяли штамм "Алтайский", который был выделен из природной популяции непарного шелкопряда в 2004 г. во время вспышки массового размножения на территории Горного Алтая (Онгудайский р-н). Для выделения и очистки вируса из погибших насекомых применяли центрифугирование по известной методике (Kawabarata, Matsumoto, 1973). Очищенный вирус хранили при температуре +2° C. Для экспериментов использовали суспензию вируса в четырех концентрациях: 105, 5 * 105, 106, 5 * 106 полиэдров на 1мл. Коли-
чество полиэдров определяли под световым микроскопом с помощью камеры Горяева.
Часть яиц непарного шелкопряда, из которых выращивали насекомых в данной работе, использовали для диагностики скрытого вируса с помощью ПЦР. Для анализа отбирали по 100 яйцекладок, каждую очищали от пушка и отделяли яйца друг от друга. Из отдельной яйцекладки брали по 20 жизнеспособных яиц и стерилизовали с поверхности. Для этого яйца перемешивали в течение 10 мин в 0.25%-ном растворе NaOH на магнитной мешалке. Затем яйца промывали стерильной водой и сушили. В стерильных условиях из яиц извлекали эмбрионы и помещали в пробирки Eppendorff по 20 особей в каждую. Образцы хранили при -70° С до проведения ПЦР.
Суммарную ДНК из образцов насекомых выделяли с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК ("Лаборатория МЕДИГЕН", Россия) в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию ПЦР-продукта гена белка слияния Ld130 проводили в 20 мкл буфера, содержащего 10 мкл PyroStart™ Fast PCR Master Mix (2X) ("Fermentas", США); 0.1 мкМ прямого и обратного прай-меров и 27.5% ДНК по объему. Дизайн специфических праймеров выполняли по полногеномной последовательности ВЯП непарного шелкопряда, задепонированной в базе данных GenBank под номером NC_001973. Структура разработанных праймеров для определения ДНК ВЯП непарного шелкопряда в биологических образцах:
прямой: 5' CGGGCATCATCCGCGGCC 3' (127651 - 127668)
обратный: 5' CGCCCTCCAGCTCCGCGC 3' (127944 - 127927).
ПЦР проводили на амплификаторе "DNA Engine Dyad® Peltier Thelmar
Cycler" ("BIO-RAD", США) в режиме: денатурация 30 с - 94° С, отжиг 30 с - 68° С и синтез 30 с - 72° С - 37 циклов; синтез 7 мин - 72° С. Размер амплифицируемого фрагмента составлял 294 пн.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты по исследованию проявления спонтанного полиэдроза среди потомков особей, выживших после инфицирования ВЯП гусениц IV возраста, представлены в табл. 1. Заражение гусениц родительского поколения непарного шелкопряда ВЯП в концентрациях от 105 до 5 х 106 полиэдров/мл вызывало смертность насекомых от 33.3 до 78%. Незначительная гибель насекомых
Таблица 1. Смертность непарного шелкопряда от полиэдроза после инфицирования ВЯП гусениц родительского поколения, а также при спонтанном полиэдрозе у потомков выживших особей
Родительское поколение Дочерние поколения
F1 F2
Смертность насекомых от 33.3 ± 4.2 (105)* 11.3 ± 3.0 b** 12.1 ± 3.1 b
полиэдроза, % 48 ± 5.9 (5105) 16.4 ± 4.2 b 10.5 ± 4.3 b
57.3 ± 6.2 (106) 14.2 ± 3.2 b 15.2 ± 3.7 b
78 ± 6.7 (5106) 19.1 ± 3.2 с 17.1 ± 3.5 b
0.7 ± 0.03 (0) 1.3 ± 0.1 a 0.7 ± 0.03a
*В скобках указана концентрация вируса при инфицировании гусениц родительского поколения (полиэдров на 1 мл). "Разными буквами отмечены значения смертности насекомых от спонтанного полиэдроза, достоверно различающиеся при Р = 0.01.
от полиэдроза (<1.5%) наблюдалась у интактных насекомых в родительском и дочерних поколениях. Однако во всех случаях значения смертности насекомых от полиэдроза отличаются (р < 0.01) от аналогичного показателя у интактных насекомых. Вероятно, смертность у контрольных насекомых может объясняться проявлением спонтанного полиэдроза, характерного для особей природных популяций непарного шелкопряда (Ильиных, Ульянова, 2005). Не наблюдалось достоверной корреляции (R = 0.21) между концентрацией вируса, которым инфицировали насекомых в родительском поколении, и количеством погибших насекомых от спонтанного полиэдроза в дочерних поколениях, и лишь в одном случае (поколение F1) наблюдались достоверные различия в гибели насекомых от по-лиэдроза, инфицированных концентрациями вируса 105 и 5 х 106 полиэдров. Необходимо отметить, что в целом результаты по смертности насекомых от спонтанного полиэдроза в обоих дочерних поколениях были весьма схожи (см. табл. 1).
Исследование проявления спонтанного поли-эдроза у особей дочернего поколения F1, полученных в результате скрещивания инфицированных самок с контрольными самцами, а также контрольных самок с инфицированными самцами, достоверных различий не выявило: смертность насекомых составила 12.4 ± 1.1 и 10.1 ± 0.9% соответственно (p < 0.01).
Результаты ПЦР показали, что вирусная ДНК присутствует в анализируемых образцах из эмбрионов, выделенных из яиц непарного шелкопряда, собранных в очаге массового размножения. Уровень скрытого вирусоносительства составил 22 ± 3% (табл. 2), который у интактных насекомых оставался практически на прежнем уровне в обоих поколениях.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.