БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 2, с. 157-160
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.3
ДЕНАТОНИУМ СТИМУЛИРУЕТ Са2+-СИГНАЛИЗАЦИЮ ВО ВКУСОВЫХ КЛЕТКАХ ТИПА I
© 2013 г. Р. А. Романов, Г. Д. Чурбанов, О. А. Рогачевская, С. С. Колесников
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3; электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com Поступило в редакцию 12.12.2012 г.
БО1: 10.7868/80233475513020060
Популяция клеток вкусовой почки гетероген-на и включает три типа вкусовых клеток, отличающихся морфологически, функционально и на молекулярном уровне. Основной класс хемосен-сорных клеток вкусовой почки составляют клетки типа II, среди которых сосуществуют функционально различные субпопуляции клеток типа II, специализирующиеся на распознавании сладких и горьких веществ и аминокислот, соответственно [1, 2]. Ранее нами было показано, что вкусовые клетки типа I и типа III экспрессируют ген полимодального гептаспирального рецептора CASR (extracellular calcium-sensing receptor) [3] и что де-натониум (но не другие горькие и некоторые сладкие вещества) стимулирует CASR в экспрес-сионной системе [4]. Примечательно, что в работе Хакера и соавторов [5] были описаны две субпопуляции горькочувствующих клеток, которые отвечали на горький стимул (0.5 мМ циклогекси-мид + 10 мМ денатониум) кратковременной мобилизацией внутриклеточного Са2+. Одна субпопуляция естественно включала клетки типа II, а вторая группа оказалась клетками типа III. Хотя в работе [5] рецепторные механизмы генерации Са2+-ответов клетками типа III остались невыясненными, в свете наших данных [4] вполне вероятно, что смесь циклогексимида и денатониума стимулировала Са2+-мобилизацию за счет того, что денатониум активировал CASR, функционирующий в этих клетках. Если это так, то вполне вероятно, что клетки типа I также способны отвечать на денатониум.
Эта идея проверялась нами в экспериментах с использованием диссоциированных вкусовых почек, выделенных из желобоватого вкусового сосочка мыши, как описано ранее [6, 7]. Этот клеточный препарат содержит индивидуальные удлиненные вкусовые клетки всех трех типов, некоторое количество округлых эпителиальных
клеток и небольшие клеточные ассоциаты. Ранее нами было показано, что если содержание Са2+ в экстраклеточном растворе не превышает 1 мМ, то внеклеточный АТР (1—10 мкМ) вызывает Са2+-ответы значительной амплитуды (AF/F> 0.5 для Fluo-4) только во вкусовых клетках типа I (экс-прессируют метаботропные пуринорецепторы P2Y типа [8]), и по этому параметру таковые могут быть отличены от вкусовых клеток других типов [3]. Следует отметить, что эпителиальные клетки также отвечают на внеклеточный АТР значительной мобилизацией внутриклеточного Са2+. Поэтому в описываемых ниже экспериментах, которые проводились с использованием Са2+-зонда Fluo-4 и микрофотометрии (Ca2+ imaging), вкусовые клетки типа I идентифицировались как имеющие характерную морфологию (удлиненная грушевидная форма) и одновременно высоко чувствительные к 10 мкМ АТР (AF/F > 1).
Эксперименты проводились по следующему протоколу. Клеточная суспензия помещалась в фотометрическую камеру [3], содержащую 4 мкМ Fluo-4AM в физиологическом растворе, дно которой было покрыто адгезивным материалом Cell-Tak. После инкубации (~20 мин), достаточной для загрузки зонда в клетки и их прикрепления ко дну камеры, последняя промывалась и помещалась в флуоресцентный микроскоп (Axioscop-2) для анализа внутриклеточной динамики Са2+. Клетки кратковременно (5—20 с) стимулировались АТР (10 мкМ); те из них, которые имели удлиненную форму и генерировали интенсивные пики внутриклеточного Са2+, отбирались для дальнейшего анализа.
Первоначально клетки типа I стимулировались смесью горьких веществ, содержащей 0.1 мМ циклогексимида, 1 мМ денатониума и 10 мМ окта-ацетата сахарозы. Всего было проанализировано 119 клеток типа I, и из них 41 клетка (34%) отве-
158
РОМАНОВ и др.
а
10 мкМ АТР
горькая смесь
3 мкМ U73122 горькая смесь
20 с
AF/F0 = 0.5
10 мкМ АТР
1 мМ денатониум
1 мМ ЦГ + 10 мМ ОАС
15 с
AF/F0 = 0.4
10 мкМ АТР
1 мМ денатониум Сладкая смесь
1 мМ денатониум
3 мкМ NPS-2143
15 с
| AF/F0 = 0.5
Ответы вкусовых клеток типа I на денатониум.
а — Последовательная регистрация ответов 8 вкусовых клеток на АТР (10 мкМ) и смесь горьких веществ (0.5 мМ цик-логексимид + 10 мМ денатониум) в контроле и в присутствии U73122 (3 мкМ).
б — Репрезентативный ответ вкусовой клетки на АТР (10 мкМ), денатониум (1 мМ) и смесь 1 мМ циклогексимида (ЦГ) и 10 мМ октаацетата сахарозы (ОАС).
в — Последовательная регистрация ответов 8 вкусовых клеток на АТР (10 мкМ), денатониум (1 мМ) и смесь сладких веществ (1 мМ аспартам + 0.1 мМ неотам + 0.3 мМ SC45647).
г — Последовательная регистрация ответов 8 вкусовых клеток на денатониум (1 мМ) в контроле и в присутствии ингибитора CASR NPS-2143.
Вкусовые клетки типа I идентифицировались по их грушевидной форме и выраженным ответам на 10 мкМ АТР. Везде данные представлены в виде AF/Fq, где AF = F — F0, F — интенсивность флуоресценции Fluo-4 в данный момент времени, Fq — интенсивность флуоресценции Fluo-4 в момент начала регистрации. Флуоресценция возбуждалась с помощью светодиода при длине волны 480 ± 10 нм и регистрировалась в области 525 ± 20 нм с помощью цифровой камеры Andor DU888 (Andor Technology, США) и программы Workbench 6.0 (INDEC Biosystems, США). Во всех случаях клетки перфузировали раствором (мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES-NaOH (pH 7.4), 5 глюкозы.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ том 30 № 2 2013
в
г
ДЕНАТОНИУМ СТИМУЛИРУЕТ Са2+-СИГНАЛИЗАЦИЮ
159
тила на горький стимул хорошо выраженной мобилизацией внутриклеточного Са2+ (рисунок а). Ингибитор фосфолипазы С и73122 (3 мкМ) полностью блокировал Са2+-ответы на горький стимул (рисунок а). Это свидетельствовало о том, что данные клеточные ответы генерировались при участии каких-то мембранных рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидным каскадом, а не за счет неспецифического действия горьких веществ, например, на активность Са2+-проница-емых ионных каналов. Оказалось, что действующим началом в горькой смеси является денатони-ум, в то время как циклогексимид и октаацетат не стимулировали Са2+ сигнализацию в использовавшихся концентрациях (рисунок б). Специфичность действия денатониума также подтверждалась тем фактом, что клетки, чувствительные к этому горькому веществу, не генерировали Са2+-ответы на сладкую смесь: 1 мМ аспартам + 0.1 мМ неотам + 0.3 мМ 8С45647 (п = 8) (рисунок в).
Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что вкусовые клетки типа I способны специфически отвечать на денатониум. Этот результат не был полностью неожиданным, поскольку известно, что вкусовые клетки этого типа экспрессируют гептаспиральный рецептор СЛ8Я [3] и что денатониум (но не другие горькие и некоторые сладкие вещества) стимулирует СЛ8Я в экспрессионной системе [4]. Эти данные предполагали, что СЛ8Я мог бы быть тем мембранным рецептором, который обеспечивает чувствительность клеток типа I к денатониуму. В подтверждение этому, NPS-2143 (антагонист СЛ8Я) полностью и необратимо подавлял ответы этих клеток (п = 9) (рисунок г).
В заключение отметим, что генетический нокаут фосфолипазы Ср2 и катионного канала ТЯРМ5 — ключевых сигнальных элементов каскада вкусовой трансдукции в клетках типа II — приводит к почти полной потере чувствительности генетически модифицированных животных к горьким и сладким веществам и аминокислотам [9—11]. Это означает, что обнаруженная нами чувствительность клеток типа I к денатониуму, скорее всего, играет вторичную роль в чувствительности периферического вкусового органа к дена-тониуму. Следует, однако, отметить, что в качестве одного из подходов к идентификации вкусовых клеток типа II в клеточной суспензии используются ответы на смесь вкусовых веществ, которая обычно включает денатониум, как один из наиболее эффективных вкусовых стимулов [12]. Наши данные однозначно свидетельствуют о том, что денатониум не может быть использован для идентификации вкусовых клеток.
Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН "Механизмы интеграции молекулярных систем при реализации физиологических функций", РФФИ (11-04-00057а) и Мин-обрнауки РФ (соглашение 8782).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chandrashekar J., Hoon M.A., Ryba N.J., Zuker C.S. 2006. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444, 288-294.
2. Chaudhari N., Roper S.D. 2010. The cell biology of taste. J. Cell Biol. 190, 285-296.
3. Bystrova M.F., Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. 2010. Functional expression of the extracellular calcium-sensing receptor in mouse taste cell. J. Cell. Sci. 123, 972-982.
4. Rogachevskaya O.A., Churbanov G.D., Bystrova M.F., Romanov R.A., Kolesnikov S.S. 2011. Stimulation of the extracellular Ca2+-sensing receptor by denatonium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 433-436.
5. Hacker K., Laskowski A., Feng L., Restrepo D., Medler K. 2008. Evidence for two populations of bitter responsive taste cells in mice. J. Neurophysiol. 99, 1503-1514.
6. Романов Р.А., Хохлов А.А., Колесников С.С. 2005. Входящий ток, активируемый АТР во вкусовых клетках мыши. Биол. мембраны. 22, 326-331.
7. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee RE, Kolesnikov S.S. 2007. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. EMBO J. 26, 657-667.
8. Bystrova M.F., Yatzenko YE., Fedorov I.V., Rogachevskaja O.A., Kolesnikov S.S. 2006. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. Cell Tissue Res. 323, 377-382.
9. Zhang Y, Hoon M.A., Chandrashekar J., Mueller K.L., Cook B., Wu D., Zuker C.S., Ryba N.J. 2003. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell. 112, 293301.
10. Dotson C.D., Roper S.D., Spector A. C. 2005. PLCß2-independent behavioral avoidance of prototypical bitter-tasting ligands. Chem. Senses. 30, 593-600.
11. Damak S., Rong M., Yasumatsu K., Kokrashvili Z., Perez C.A., Shigemura N., Yoshida R., Mosinger B.Jr.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.