ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 87, № 6, с. 1037-1044
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ^^^^^^^^^^ ПОВЕРХНОСТНЫХ ЯВЛЕНИЙ
УДК 535.372.3;538.958
ДЕНАТУРАЦИЯ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦЕТИЛТРИМЕТИЛАММОНИЙБРОМИДА ПО ДАННЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА © 2013 г. И. М. Власова, В. В. Журавлева, А. М. Салецкий
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет
E-mail: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 24.05.2012 г.
Исследована триптофановая флуоресценция бычьего сывороточного альбумина (БСА) в растворах с различными концентрациями катионного детергента цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) при различных значениях pH, на основании чего получена информация о денатурации БСА под действием ЦТАБ. По тушению триптофановой флуоресценции БСА, по увеличению степени поляризации триптофановой флуоресценции БСА, по значениям параметров вращательной диффузии молекул БСА в растворах с ЦТАБ обнаружено, что денатурация БСА под действием ЦТАБ при всех исследованных значениях pH (3.5—8.0) носит моностадийный характер. Показано, что катионный детергент ЦТАБ эффективнее денатурирует БСА при значениях pH, больших изоэлектрической точки pI БСА (4.9).
Ключевые слова: бычий сывороточный альбумин, денатурация, ионные детергенты, триптофан, флуоресценция.
Б01: 10.7868/80044453713060319
Бычий сывороточный альбумин (64 кДа) представляет собой глобулярный белок плазмы крови. Уникальная способность молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА) связывать обширный круг органических и неорганических лиган-дов определяет одну из основных функций этого белка — транспорт физиологических метаболитов. Основой взаимодействий молекулы БСА с лигандами является структурная подвижность этой белковой молекулы, обеспеченная уникальной петлевой укладкой полипептидной цепи белка из 582 аминокислотных остатков [1]. Вторичная структура БСА состоит из а-спиральных участков и участков хаотической укладки при физиологическом значении рН, содержание Р-склад-чатых структур крайне незначительно (~1%). Третичная структура БСА определяется тремя доменами.
Таким образом, БСА является типичным представителем гомологичного семейства сывороточных альбуминов. Уровни структурной организации БСА практически идентичны уровням структурной организации сывороточного альбумина человека (САЧ) [1]. БСА и САЧ практически гомологичны и отличаются лишь некоторыми аминокислотными остатками. В частности, САЧ содержит один остаток триптофана Тгр 214, а БСА содержит два остатка триптофана — Тгр 135 и Тгр 214.
Выбор БСА в данной работе как модельного белка обусловлен важной ролью этого белка в плазме крови, определяемой широким разнообразием функций этого белка: альбумин обеспечивает коллоидно-осмотическое давление крови, альбумин регулирует вместе с другими белками плазмы рН крови, альбумин служит переносчиком различных метаболитов.
Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, т.е. нарушение, разупорядочивание системы не-ковалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, что обуславливает интерес к изучению механизмов белковой денатурации. Денатурация белков может быть вызвана действием ряда факторов [2].
Например, повышение температуры приводит к тепловой денатурации. Также денатурации способствует воздействие на белок реагентов, нарушающих нековалентные взаимодействия, прежде всего систему водородных связей, — например, концентрированных растворов мочевины (6—8 М).
Денатурирующим действием на белки обладают и органические растворители. Они способны устанавливать контакты с гидрофобными аминокислотными остатками белка, лишая гидрофобное ядро его стабилизирующей роли. Одновре-
менно многие растворители, например, спирты, муравьиная кислота, как бы переключают на себя водородные связи, поддерживающие третичную структуру.
Денатурация белков может происходить и при экстремальных значениях рН. В сильнокислых растворах (при рН ниже 2) полностью протониру-ются отрицательно заряженные карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Это приводит к тому, что на поверхности белка сохраняются только положительные заряды катионных групп, взаимное отталкивание которых приводит к развертыванию глобул. В щелочных растворах (при рН 11 и выше) утрачиваются положительные заряды аминогруппы лизина и приобретают отрицательные заряды фенольные группы тирозина, что ведет к резкому преобладанию отрицательных зарядов и развертыванию глобул белка [2].
Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты [2]. Детергенты представляют собой органические амфифильные соединения, молекулы которых имеют гидрофильные и гидрофобные участки. По типу гидрофильных групп различают несколько типов детергентов — ионные и неионные. Ионные детергенты диссоциируют в растворе на ионы, одни из которых поверхностно активны, а другие (проти-воионы) — нет. В зависимости от знака заряда поверхностно-активного иона ионные детергенты делят на анионные, катионные и амфотерные [3, 4].
Основную долю в фармацевтических, медицинских и биохимических исследованиях составляют ионные детергенты, обладающие денатурирующими свойствами, такие как анионный детергент додецилсульфат натрия ДСН (критическая концентрация мицеллообразования ККМ 8.2 мМ по [4]), применяющийся в электрофоретических исследованиях, и катионный детергент цетилтри-метиламмонийбромид ЦТАБ (ККМ 0.9 мМ по [4]), проявляющий бактерицидные свойства и при щелочных рН активный против грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий [3—5].
Денатурация САЧ под действием ДСН и под действием ЦТАБ была изучена нами ранее спектроскопическими методами. В частности, денатурация САЧ под действием ДСН была изучена нами методами КР-спектроскопии [6], методами флуоресцентного анализа — по собственной флуоресценции белка [7, 8] и по флуоресценции на-номаркера эозина, добавленного в растворы САЧ [9]. Денатурация САЧ под действием ЦТАБ была изучена нами методами КР-спектроскопии и флуоресцентного анализа в [10, 11].
Представляет интерес исследовать денатурацию БСА под действием ЦТАБ по анализу собственной триптофановой флуоресценции белка, как неполяризованной, так и поляризованной. Исследование триптофановой собственной флу-
оресценции белков широко применяется для оценки конформационного состояния белковых молекул [12—16]. Также представляет интерес определить параметры вращательной диффузии молекул БСА в растворах с ЦТАБ при различных значениях pH по исследованиям поляризованной триптофановой флуоресценции БСА с учетом формулы Левшина—Перрена [17—19] по разработанной нами методике для биологических белковых систем [20].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растворы БСА (Sigma) получены путем разведения белка до концентрации 5 мкМ в двух различных буферных системах: 0.1 М CH3COOH-KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2PO4 - 0.1 М NaOH (pH 5.5-8.0). В растворы БСА при различных значениях pH (3.5-8.0) добавлены различные концентрации ЦТАБ (0.5-7.0 мМ). Для анализа вращательной диффузии молекул БСА в итоговые растворы добавлены различные концентрации сахарозы (0-200 мМ).
Флуоресцентные исследования проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS55, спектрально-флуоресцентные характеристики приготовленных образцов исследовались при комнатной температуре.
Триптофановая флуоресценция БСА регистрировалась в диапазоне 300-500 нм при возбуждении светом с длиной волны ^возб = 295 нм. Степень поляризации P триптофановой флуоресценции БСА рассчитывалась по значениям I и /± в максимуме спектра испускания флуоресценции белка, где Ц и /± - интенсивности свечений, поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Спектры флуоресценции обрабатывались программой Perkin Elmer FL Winlab.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Неполяризованная триптофановая флуоресценция БСА в исследовании денатурации БСА под действием ЦТАБ
На основе анализа спектров неполяризованной триптофановой флуоресценции (^возб = 295 нм) БСА в растворах с различными концентрациями ЦТАБ при различных значениях pH построены зависимости интенсивности в максимуме спектра (I фтлах) триптофановой флуоресценции БСА от концентрации ЦТАБ (рис. 1). Видно, что, как в отсутствие ЦТАБ, так и при наличии этого детергента, при увеличении значения pH происходит увеличение интенсивности в максимуме спектра
' фл
триптофановой флуоресценции БСА.
При всех значениях рН в растворах с ЦТАБ наблюдается тушение триптофановой флуоресцен-
/фТ, отн. ед. рн
ЦТАБ, мМ
Рис. 1. Зависимости интенсивности в максимуме спектра (Тфл ) триптофановой флуоресценции (^возб = 280 нм) БСА (5 мкМ) от концентрации ЦТАБ при различных значениях рН: 3.5 (1), 4.0 (2), 4.5 (3), 5.0 (4), 5.5 (5), 6.0 (6), 6.5 (7), 7.0 (8), 7.5 (9), 8.0 (10). Вставка — среднее изменение интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции БСА к изменению концентрации ЦТАБ в растворах с различными значениями рН.
ции БСА (рис. 1), причем величина тушения зависит от значения рН. Тушение флуоресценции БСА в присутствии ЦТАБ в растворах объясняется денатурацией белка под действием ЦТАБ — разрыхлением глобул БСА, открытием гидрофобных карманов с триптофановыми остатками и увеличением доступности триптофановых остатков (Тгр 135 и Тгр 214) для тушащих их молекул воды.
Видно (рис. 1), что денатурация БСА под действием ЦТАБ при всех исследованных значениях рН (3.5—8.0) носит одностадийный характер — белковые глобулы постепенно разрыхляются под действием ЦТАБ примерно до концентрации 4 мМ ЦТАБ, дальнейшее увеличение концентрации ЦТАБ практически ничего не меняет в системе.
На рис. 1 (вставка) изображено среднее изменение интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции БСА к изменению концентрации ЦТАБ в растворах (АТф"1/А[ЦТАБ]) при различных значениях рН. Видно, что более сильное тушение флуоресценции БСА под действием ЦТАБ происходит при высоких значениях рН, больших изоэлектрической точки р/ БСА (4.9), что указывает на электростатический механизм взаимодействия БСА и ЦТАБ.
В растворе м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.