МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 607-618
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 578.82/.83-84
ДЕНСОВИРУС РЫЖЕГО ТАРАКАНА Blattella germanica: ОБНАРУЖЕНИЕ, НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
И ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА
© 2003 г. Д. В. Муха*, К. Шал1
Институт общей генетики им. Н И. Вавилова Российской академии наук, 119991, Москва department of Entomology, Box 7613, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA
Поступила в редакцию 26.09.2002 г.
Описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV), принадлежащий к семейству Par-voviridae (подсемейство Densovirinae, род Densovirus). Проведен электронно-микроскопический анализ вирусной ДНК и ультратонких срезов тканей рыжего таракана, инфицированных вирусом. Показано, что вирусные частицы размером около 20 нм могут локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме клеток. Вирусная ДНК длиной около 1.2 мкм имеет линейную форму. Определена полная нуклеотидная последовательность (5335 п.н.) вирусной ДНК и проведен ее компьютерный анализ. Вирусный геном содержит пять открытых рамок считывания, две из которых соответствуют структурным белкам капсиды, а три - регуляторным белкам. Открытые рамки считывания структурных белков локализуются на одной цепи ДНК, регуляторных белков - на комплементарной. Выявлены потенциальные промоторы и участки полиаденилирования. Проведен структурный анализ концевых инвертированных повторов, содержащих протяженные палиндромные последовательности. Организация генома денсовируса рыжего таракана обсуждается в сравнении с организацией генома других представителей семейства Parvoviridae.
Ключевые слова: денсовирусы насекомых, геном, таракан Blattella germanica.
Денсовирусы входят в семейство Parvoviridae, которое состоит из двух подсемейств - Parvovirinae и Densovirinae. Представители Densovirinae - парвови-русы членистоногих, главным образом насекомых. Известно пять отрядов насекомых (Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Diptyoptera и Odonate), у представителей которых обнаружены денсовирусы [1]. Свое название эти вирусы получили потому, что ядра зараженных клеток сильно гипертрофированы и содержат плотные, темные Фульген-позитивные массы вирионов [2]. Как правило, заражение денсо-вирусами приводит к гибели их хозяев [3].
Гексагональные частицы денсовирусов диаметром 19-22 нм содержат линейную однонитевую молекулу ДНК длиной примерно 5-6 т.н. Вирусные частицы могут преимущественно содержать нить ДНК, комплементарную мРНК (например вирус Aedes aegypti, AeDNV), или обе нити ДНК в примерно равном соотношении (например вирус Junonia coenia, JcDNV) [4]. Если в разных вирусных частицах упакованы как "плюс", так и "минус" нити, при выделении суммарной ДНК в условиях высокой концентрации соли происходит формирование двухцепочечной ДНК (дцДНК).
На концах ДНК денсовирусов локализованы концевые инвертированные повторы (КИП), способные формировать вторичные структуры. Нук-
* Эл. почта: myxa@vigg.ru
леотидные последовательности обоих КИП могут быть одинаковыми (JcDNV) [5] или различаться (AeDNV) [6]. КИП играют важную роль в автономной репликации вирусной ДНК [4]. Геномы всех денсовирусов, секвенированные к настоящему времени, содержат несколько открытых рамок считывания (ОРС). В зависимости от типа вируса ОРС могут находиться на одной или обеих цепях ДНК. Часть из них кодирует белки капсиды, часть - регуляторные белки [4].
Денсовирусы, измененные методами генетической инженерии, могут использоваться в качестве удобных векторов для генетических манипуляций с насекомыми. Другое направление применения денсовирусов - биологический контроль численности насекомых-вредителей [7-9].
Нами открыт и описан денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV), проведено клонирование и секвенирование его ДНК. Организация генома BgDNV обсуждается в сравнении с организацией генома других представителей семейства Parvoviridae.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Суммарную ДНК выделяли из отдельных особей B. germanica, отловленных на территории США, и лабораторных линий.
т.п.н.
Рис. 1. Выделение ДНК вируса рыжего таракана Blattella germanica. Электрофорез в 1%-ном агарозном геле суммарной ДНК, выделенной из неинфицирован-ного (1) и инфицированного вирусом таракана (2). 3 - Очищенная вирусная ДНК. Стрелкой указана фракция вирусной ДНК.
Выделение суммарной ДНК рыжего таракана и плазмидной ДНК, обработку эндонуклеазами, гель-электрофорез и выделение фрагментов ДНК из геля проводили согласно протоколам [10, 11].
Электронная микроскопия. Препараты ДНК анализировали на просвечивающем электронном микроскопе (увеличение 30000 раз). Использова-
ли смесь вирусной и плазмидной ДНК (2 : 1). ДНК обрабатывали согласно [12] и наносили на сеточки, покрытые формваровой пленкой и напыленные графитом. ДНК окрашивали уранилацета-том и оттеняли в платино-палладиевых парах.
Для получения ультратонких срезов ткани тараканов фиксировали, заливали в смолу и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца согласно [13].
Вирусный геном клонировали в плазмидном векторе (риС119) с использованием метода, основанного на добавлении одноцепочечных гомопо-лимерных фрагментов (примерно по 20 н. на каждый конец) и последующем отжиге векторной и клонируемой ДНК.
Вирусную дцДНК выделяли из агарозного геля [10]. Добавляли гомополимерные фрагменты (полив). Реакционная смесь содержала 0.3 мкг вирусной ДНК, 100 мМ какодилата калия (рН 7.2), 2 мМ СоС12, 0.2 мМ дитиотреитола, 0.1 мМ ёвТР и 30 ед.акт. терминальной дезоксинуклеотидилтран-сферазы ("ОШсоВКЬ") в объеме 200 мкл. Смесь инкубировали 1 ч при 37°С. Плазмиду риС119 обрабатывали рестриктазой Psй, фракционировали в 0.7%-ном агарозном геле и линеаризированную форму экстрагировали из геля [10]. К линейной плазмидной ДНК добавляли гомополимерные фрагменты (полиС). Реакционная смесь содержала 0.1 мкг плазмидной ДНК, 100 мМ какодилата калия (рН 7.2), 2 мМ СоС12, 0.2 мМ дитиотреитола, 0.02 мМ ёСТР и 15 ед.акт. терминальной дез-оксинуклеотидилтрансферазы ("01ЪсоВЯЬ") в объеме 50 мкл. Смесь инкубировали 30 мин при
Рис. 2. Электронно-микроскопическая фотография вирусной ДНК. * - Линейная вирусная ДНК. ** - Маркерная кольцевая ДНК плазмиды рЙС19.
Вирусную и плазмидную ДНК отжигали в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0.25 мкг вирусной ДНК, 0.05 мкг плазмидной ДНК, 10 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 0.1 M NaCl, 1 мМ EDTA. Смесь инкубировали 5 мин при 65°С и 60 мин при 57°С. После инкубации 5 мкл реакционной смеси использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli XL2-Blue MRF' ("Strat-agene").
Секвенирование ДНК. Плазмиды pVir-8 и pPst-Vir, содержащие перекрывающиеся фрагменты вирусного генома (описание плазмид приведено в тексте), секвенировали по методу Сэнгера [14] с использованием ДНК-секвенатора ABI PRISMTM377 и набора реактивов dGTP Big Dye Termination Kit ("PE Applied Biosystems", Foster City CA).
Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности. Предсказание промоторов, по-ли(А)-участков, ОРС, аминокислотных последовательностей, кодируемых этими ОРС, множественные и попарные сравнения фрагментов ДНК выполнены с использованием пакета программ "BCM Search Launcher" [15] (http://searchlaunch-er.bcm.tmc.edu). Для предсказания вторичных структур КИП использовали программу FOLD [16]. Профиль температурной денатурации дцДНК вируса рассчитан на основе алгоритма Поленда [17, 18] программой (http://www.biophys.uniduesseldorf.de/lo-cal/POLAND/poland.html).
Рис. 4. Электронно-микроскопическая фотография инфицированных вирусом клеток пищеварительного тракта Blattella germanica. а - Общий вид вирогенной стромы. б - Вирусные частицы с электронно-прозрачным центром, окруженным электронно-плотной стенкой (показаны тонкими стрелками) и с электронно-плотным центром (показано жирными стрелками).
EcoRI BglII PstI EcoRI
_J_и_o_
I
HindIII\
KpnI
EcoRI Hindm
KpnI EcoRI
Рис. 3. Схема клонирования вирусной ДНК. а - Частичная рестрикционная карта вирусной ДНК. б — плазмида рУ1г-8 - плазмида риС119, содержащая клонированный вирусный геном с делецией (~150-200 п.н.) концевого инвертированного повтора, расположенного около ЯшёШ-участка плазмиды. Делетированный в рУ1г-8 участок вирусной ДНК обозначен пунктиром (а). в - рРз^Уп" - плазмида риС119, содержащая фрагмент вирусного генома с интакт-ным концевым инвертированным повтором.
37°С. После добавления гомополимерных фрагментов как вирусную, так и плазмидную ДНК осаждали этанолом, затем промывали 70%-ным этанолом и растворяли в 50 мкл воды.
а
^биу
вшВЫУ Бзот ррт
BgDNУ
^биу
GmDNУ DsDNУ Р^Ш BgDNУ
JcDNУ
GmDNУ
DsDNУ
Р^Ш
BgDNУ
JcDNУ
GmDNУ
DsDNУ
Р^Ш
BgDNУ
¡¡¡¡¡а|1тстИ^
||||১аас||са|-^ 1|§|т§|тАс11сА§-с11^
§|||Т||ТСТ||9Т|СА||^^ ... 3009
Мотив № 1
|тс§аа§|ст|т|-асса||т||тс§ааас§тЩ §ТС|аа§|СТ|Т|-ТССС|§Т||ТС§А^ |тс|аа||ст|т|-асса||т||тс|ааас^ |тс|та11с-1т1сасса||а||ас|т^
1АТ|СС||С-|С|ААТТА||А||^^ ...3098
Ыт|1ттсосаост|1|Я^ |С|Т|§тттосасст||^
§Т§С§|ТТАТСОСАА||||§-^^ • ■ ■3184
Мотив № 2
Т|АТ|||||||А|||с1|А||ТЗ|А||ас||||Т||А!||| Т с АТ ЙТС А ААМ^ЙА АТТ т ТТ А С С АССАСТС &Й А т|атИ1111аВсИа||т||Шас111|т1|а;||| - С АС м- САМАААСМСТ? СТТ Т ССТССАСТТ ЙСАС&А АС-С^ТСЛМСМААДСТТТТ1СССАССаСТА0СТ©СА. . . 3221
Рис. 5. Сравнение последовательности нуклеотидов фрагмента ОРС3 Д^ЭМУ и других денсовирусов насекомых (Р/ОМУ, /сОМУ, ОшОМУ и ЛЮКУ). Темным выделены идентичные нуклеотиды. 1 и 2 - высококонсервативные мотивы.
а 80
ТСССССААССССАСАССТТССАССОСССССССССАССТСССОСТСОАССССССАСТССТССАССТТСАСТТСААСССААС
а
160
САТСОТТАТТТАСАТТТААТСАААТСААССОСТТСАТСОТТСААОТСААССТССАСОАСТССССССТССАСССССАОСТС
а'
Р1 240
сссссссссстссаасстстссссттсссссаассассаасатсаасоттаааааосссоооааасасстсса6ТСОТТА
СтартОРС2 Ь 320
СТАТСТСТАССТСССССТТАСАСТСАСТСССТТТСТТАССАСТСААТАСТССААСАСТССААТАТССТССААТАСАСССА
Старт ОРС5 5120
^__Р2
тттааасатсссаттасстасстасстстсстстсстссаасттсаасттасаасТааатсссстссаасатсстссстс
5200
СТТТТАТССТТСАТТТТОСТССТТСССССААОСССАСАССТТССАССССССОССССАССТОССОСТССАСССООСАОТСС Ь' а
5280
ТССАССТТ0АСТТСААССАТ0ААСС06ТТ0АТТТСАТТАААТСТАААТААССАТ66ТТС0СТТ6АА6ТСААС0ТС6АС0А
5335
СТССССССТССАСССССА
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.