БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 1-2, с. 123-132
УДК 577.352.465
ДЕПО-ЗАВИСИМЫЙ ВХОД КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКИ НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SK-N-SH, МОДЕЛИРУЮЩИЕ БОЛЕЗНЬ ХАНТИНГТОНА
© 2012 г. В. А. Вигонт1, О. А. Зимина1, Л. Н. Глушанкова1, И. Б. Безпрозванный2,
Г. Н. Можаева1, Е. В. Казначеева1*
Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр., 4, Санкт-Петербург, 194064, Россия; *электронная почта: evkazn@mail.cytspb.rssi.ru 2Отдел физиологии Юго-западного медицинского центра Техасского университета в Далласе, 75390 США
Поступила в редакцию 19.08.2011 г.
Болезнь Хантингтона — аутосомно-доминантное нейродегенеративное заболевание, обусловленное мутацией в гене белка хантингтина, которая приводит к увеличению длины полиглутаминового тракта в N-концевой области белка. При данном заболевании прежде всего страдают срединные шипиковые нейроны (СШН) стриатума. В качестве клеточной модели болезни Хантингтона использовали клетки нейробластомы человека SK-N-SH, трансфицированные конструкцией для экспрессии мутантного хантингтина (Htt138Q). Показано, что экспрессия Htt138Q вызывает увеличение депо-зависимого кальциевого входа в клетках SK-N-SH. Также показано, что соединение EVP4593 способно осуществлять обратимый блок аномального депо-зависимого ответа, а сам ответ, по-видимому, опосредован каналами, несущими в своем составе субъединицу TRPC1 (short transient receptor potential channel 1).
Ключевые слова: болезнь Хантингтона, нейродегенерация, кальций, SOC, TRPC1.
Болезнь Хантингтона является аутосомно-до-минантным нейродегенеративным заболеванием, вызванным увеличением количества глута-мин-кодирующих повторов в первом экзоне гена белка хантингтина. В норме длина полиглутаминового тракта не должна превышать 35 остатков глутамина (НИ), в то время как у больных длина тракта может достигать 36—100 и даже более остатков глутамина (НИехр). При болезни Хантингтона в первую очередь поражаются срединные шипиковые нейроны (СШН) стриатума [1]. Тем не менее, связь между НИехр и дегенерацией нейронов до сих пор остается неясной.
Одна из гипотез, объясняющих развитие патологических состояний при болезни Хантингтона, заключается в том, что НИехр нарушает кальциевую сигнализацию, что, в конечном итоге, приводит к клеточной гибели. Ранее показано, что Нйехр усиливает функцию рецептора ММЭА [2], а также увеличивает сродство внутриклеточного рецептора 1Р3 к лиганду [3]. В обоих случаях наблюдалось повышение концентрации свободного кальция в цитозоле: в первом случае за счет увеличенного входа кальция из внешней среды через рецептор ММЭА в ответ на небольшие концентрации глу-тамата, освобождаемые нейронами кортикостри-атальной проекции; во втором за счет опустошения внутриклеточного кальциевого депо в ответ на базальные концентрации 1Р3 в цитозоле. По-
вышение уровня цитозольного кальция ведет к аномальному накоплению кальция в митохондриях, патологическому запуску кальций-зависимых сигнальных путей, апоптотической активности и дегенерации нейронов стриатума [4, 5].
Одним из механизмов повышения концентрации ионов кальция в нейронах является вход кальция через депо-управляемые каналы плазматической мембраны [6]. Целью данной работы было изучение влияния НИехр на депо-зависимый вход ионов кальция в клетках нейробластомы человека 8К-М-8Н.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки. Клетки нейробластомы человека SK-N-SH из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и антибиотика (80 мкг/мл гентамицина). За 1—2 дня до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стекол (3 х 3 мм). Для лучшей адгезии клеток стекла покрывали 0.01% раствором полилизина.
Соединения EVP. EVP4593 (6-амино-4-(4-фенок-сифенетиламино)хиназолин) и EVP14808 (6-ами-но-4-(2-(3-пиридил)этиламино)хиназолин) описаны в опубликованных ранее работах [7, 8]. Соедине-
ния EVP любезно предоставлены компанией EnVivo Inc (США).
Трансфекция и РНК интерференция. Мутант-ный хантингтин экспрессировали в клетках SK-N-SH с использованием конструкции на основе вектора cPI (Promega, США), содержащей Htt138Q (последовательность, кодирующая белок хантингтин с 138 остатками глутамина). Htt138Q встраивали в вектор cPI, обладающий устойчивостью к неомицину, по XbaI/EcoR1-сайтам. В контрольных экспериментах использовали плазмиду cPI, содержащую Htt15Q (последовательность, кодирующая нормальный хантингтин с 15 остатками глутамина). Трансфицированные клетки визуализировали при помощи котрансфекции с зеленым флуоресцентным белком (GFP) (соотношение Htt : GFP = 3 : 1). Котрансфекцию проводили с использованием трансфицирующего агента Унифектин56 (ИБХ, Москва).
В экспериментах с подавлением экспрессии TRPC1 (short transient receptor potential channel 1) использовали котрансфекцию клеток конструкцией для экспрессии хантингтина, плазмидой, несущей малую интерферирующую РНК (siRNA) против TRPC1 (pSHAG-1h TRPC1 2219, любезно предоставлена Dr. L. Tsiokas, University of Oklahoma Health Science Center) и плазмидой, кодирующей GFP, в соотношении 3 : 3 : 2.
Для гиперэкспрессии TRPC1 в клетках SK-N-SH использовали котрансфекцию клеток геном Trpcl мыши в составе экспрессионного вектора pcDNA3 (конструкция любезно предоставлена Dr. S. Muallem, NIH, США) и плазмидой, кодирующей GFP, в соотношении 1 : 1.
В контрольных экспериментах использовали плазмиду с siRNA, не имеющей специфической мишени (контрольная siRNA, Sigma, США) и пустой экспрессионный (контрольный) вектор (Sigma, США).
Электрофорез и иммуноблотинг. Клетки выращивали в чашках Петри диаметром 50 мм. После трансфекции клетки лизировали в буферном растворе следующего состава: 10 мМ трис-HCl pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1% тритон X-100, 1% NP40 (Nonidet P40, неионный детергент нонилфенил-полиэтиленгликоль), 2 мМ EDTA, 0.2 мМ PMSF (ингибитор сериновых протеаз, фенилметансуль-фонилфторид) с добавлением ингибиторов протеаз (PIC, Hoffmann—La Roche AG, Германия). Белки лизатов разделяли электрофоретически в 8% полиакриламидном геле в вертикальной камере и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Белки на иммуноблоте выявляли с использованием поликлональных антител против TRPC1 (Alomone labs, Израиль, в разведении 1 : 200). В качестве вторых антител брали антитела козы против константной части иммуноглобулинов кролика (1 : 30000). Белки на иммуноблотах выявляли с помощью субстрата Super Signal Chemilu-minescent Substrate (Pierce, США). Эксперименты
повторяли как минимум 3 раза, используя различные лизаты клеток. Для контроля равной загрузки дорожек использовали моноклональные антитела против а-тубулина в разведении 1 : 1000 (Sigma, США). Процентное содержание белка сравнивали с помощью стандартной программы сравнения интенсивности окрашивания сканированного иммуноблота.
Электрофизиологические измерения. Ионные токи регистрировали с использованием метода локальной фиксации потенциала в условиях регистрации тока от целой клетки [9]. Измерения выполняли с помощью усилителяАхора1сИ 200B (Axon Instruments, США). Сопротивление микроэлектродов составляло 5—15 МОм. Последовательное сопротивление не компенсировали. Усиленный и предварительно отфильтрованный встроенным в усилитель двухполюсным фильтром Бесселя (частота среза 500 Гц) сигнал оцифровывали на частоте 5000 Гц с помощью платы АЦП L305 (L-Card, Россия). При записях интегральных токов клетки потенциал мембраны поддерживали при —40 мВ. Периодически (каждые 5 с) потенциал на мембране изменяли до —100 мВ (на 30 мс), а затем постепенно (с постоянной скоростью 1 мВ/мс) его величину изменяли до + 100 мВ. Шаг измерения составлял 0.5 мВ. Записанные токи нормировали относительно емкости клетки (10—30 пФ). Записи, полученные до активации исследуемых токов, использовали для вычитания тока утечки и тока через другие каналы.
Растворы. В измерениях тока целой клетки раствор регистрирующей пипетки содержал (в мМ): 135 CsCl, 10 EGTA-Cs, 10 HEPES-Cs, 4.5 CaCl2, 1.5 MgCl2, 4 Na-ATP, 0.4 Na2-GTP (pCa7), pH 7.3. Внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NMDG-Asp, 10 BaCl2, 10 HEPES-Cs, 0.01 тетрод-отоксина, 0.01 нифедипина, pH 7.3. Для активации депо-зависимых токов во внеклеточный раствор добавляли 1 мкМ тапсигаргина. EVP4593 и EVP14808 добавляли во внеклеточный раствор. Соединения подавали к объекту путем перфузии. Время замены раствора в камере составляло менее 1 с.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Чтобы смоделировать болезнь Хантингтона, в клетки нейробластомы человека SK-N-SH вводили конструкцию, кодирующую белок хантингтин с полиглутаминовым трактом из 138 остатков глутамина (Htt138Q). Контролем служили интакт-ные клетки (Ctrl) и клетки, экспрессирующие хантингтин с полиглутаминовым трактом из 15 остатков глутамина (Htt15Q).
Электрофизиологические опыты показали, что примерно у 80% интактных клеткок в ответ на пассивное опустошение депо тапсигаргином развивался входящий ток со средней амплитудой 0.5 пА/пФ при потенциале —80 мВ (рис. 1а—в). В
Рис. 1. Влияние экспрессии белков Htt15Q и Htt138Q на депо-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SH. a — Развитие тока (отнесенного к емкости клетки), вызванное приложением 1 мкМ тапсигаргина в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Htt15Q (белые треугольники); Htt138Q (серые круги) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (черные квадраты) при потенциале —80 мВ. Представлены данные трех репрезентативных экспериментов.
б — Средние вольт-амперные характеристики токов, полученных при пассивном опустошении депо тапсигар-гином (1 мкМ), в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Htt15Q (светло-серая линия); Htt138Q (темно-серая линия) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (черная линия) на стационарном уровне активности исследуемых токов. Количество экспериментов указано на панели (в). в — Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале —80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Htt15Q (без заливки); Htt138Q (черная заливка) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (наклонная штриховка). Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляетp < 0.05.
кле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.