УДК 577.11:579.66
ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ХИТОЗАНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА, ПРОДУЦИРУЕМОГО Myceliophthora sp.
© 2014 г. Л. М. Хасанова*, А. В. Ильина*, В. П. Варламов*, О. А. Синицына**, А. П. Синицын**, ***
*Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991 ***Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, e-mail: varlamov@biengi.ac.ru Поступила в редакцию
Получены образцы низкомолекулярного хитозана с выходом 50—80% и молекулярной массой 8—24 кДа, c одинаковой степенью дезацетилирования (85%) и одинаковым индексом полидисперсности, растворимые в диапазоне рН 5—7. Подобраны условия для проведения ферментативного гидролиза с максимальным выходом с использованием ферментного препарата, из мицелиального гриба Myce-liophtora fergusii, — рН 5.6, температура 37°C и соотношение фермент—субстрат — 1 : 800.
DOI: 10.7868/S0555109914040229
Получение наборов образцов хитозана с различными характеристиками позволит отобрать наиболее эффективные при сравнении в опытах in vitro/in vivo.
Хитозан — линейный полисахарид, состоящий из остатков 2-амино-2-дезокси-Э-глюкопирано-зы (ГА) и М-ацетамидо-2-дезокси-Э-глюкопира-нозы (АГА), связанных между собой Р-1 ^ 4 гли-козидной связью. Обычно хитозан получают в результате щелочного дезацетилирования хитина, источником которого являются членистоногие, насекомые, грибы и другие живые организмы [1, 2]. Общепринятым считается называть хитин со степенью дезацетилирования более 40% хитозаном. В настоящее время хитозан рассматривают как наиболее перспективный биополимер для применения в пищевой (в качестве пленок, загустителей, консервантов, биологически активных добавок), косметической (как структурообразователь, антисептик), медицинской и фармацевтической (в качестве ранозаживляющих пленок и гелей, носителей биологически активных веществ) отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве [3, 4]. Объясняется это свойствами биополимера, а именно низкой токсичностью, биоразлага-емостью, биосовместимостью и проявляемым спектром биологической активности [5]. Ограниченная растворимость большинства коммерческих образцов хитозана при нейтральных физиологических значениях рН 6.5—7.5 и их высокая вязкость в водных растворах требуют деполимеризации биополимера для его дальнейшего использования, например в медицине и фармацевтической промышленности. Существует два основных способа решения этой задачи — химическая и фермента-
тивная деполимеризация. Наиболее приемлемым с точки зрения ведения процесса является ферментативный метод гидролиза хитина/хитозана, направленный на расщепление О-гликозидной связи между соседними звеньями, позволяющий сохранить основную структуру и степень дезацетилиро-вания биополимера.
Для деполимеризации хитозана могут быть использованы гликозид гидролазы (КФ 3.2.1.х), а именно хитиназы и хитозаназы, которые способны гидролизовать связь между сахарными остатками последовательности цепи биополимера А1А—А1А и АГА—ГА, ГА—АГА, ГА—ГА соответственно [6]. Это свидетельствует о том, что М-ацетильные остатки по длине полимерной цепи в хитине/хитозане играют важную роль при ферментативном гидролизе биополимеров специфическими карбогидраза-ми. Однако индивидуальные ферменты — хитина-зы и хитозаназы обычно не используют для получения водорастворимого низкомолекулярного хитозана в большом объеме, что связано с их высокой стоимостью и недоступностью, поэтому чаще применяют ферментные препараты с комплексом карбогидраз, продуцируемых бактериями и грибами [7]. Сравнительно недавно для масштабного производства низкомолекулярного хи-тозана стали использовать коммерчески доступные гидролазы, которые обладают неспецифической активностью в отношении хитина/хито-зана, а именно липазы (КФ 3.1.1.х) [8], протеазы (КФ 3.4.4.х) [9, 10], карбогидразы (КФ 3.2.1.х):цел-люлазы [11], амилазы [12], пектиназы [13] и пр. Перечисленные ферментные препараты, независимо от механизма каталитического действия, проявляют хитино- и хитозанолитическую актив-
ность. Тем не менее, поиск новых продуцентов для получения ферментных препаратов, обладающих хитозанолитической активностью, сохраняет свою актуальность [14—16].
Цель работы — получение образцов хитозана, различающихся по молекулярной массе, c одинаковой степенью дезацетилирования, растворимых в диапазоне рН 5.0—7.0, подбор условий ферментативной деполимеризации хитозана с использованием доступного ферментного препарата, полученного из мицелиального гриба Myceliophtorafergusii.
МЕТОДИКА
В работе использовали сухой ферментный препарат (ФП), полученный лиофильным высушиванием культуральной жидкости штамма мицелиального гриба Myceliophthorafergusii BKM F-3932D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН) [17].
Для получения различающихся по молекулярной массе образцов хитозана, использовали крабовый хитозан с молекулярной массой (Мм) 1000 кДа и степенью дезацетилирования (СД) 85% производства ЗАО "Биопрогресс" (Щелково, Россия).
Активность гликозидаз в ФП исследовали на полисахаридных субстратах. Коллоидный хитин получали по методике, описанной в работе [18], хитозан с Мм 190-310 кДа и СД 75-85% - фирмы "Sigma" (США). Образец хитина/хитозана со СД 42% получали, используя для ацетилирования хитозан с Мм 190-310 кДа и СД 75-85% и модифицированную методику, описанную ранее в работе [19]. Хитозан с Мм 10 кДа и СД 98% был получен кислотным гидролизом исходного хитозана Мм 1000 кДа и СД 85% в лаборатории Центра "Бион-женерия" РАН согласно методике, описанной ранее [20].
Карбоксиметилцеллюлоза, п-нитрофенил-М-ацетил-Р^-глюкозаминид, азоказеин и 3,5-ди-нитросалициловая кислота получены от фирмы "Sigma", (США), М-ацетил^-глюкозамин и D-глюкозамин - "Fluka", (Германия).
Определение белка. Белок в ферментном препарате определяли по связыванию с красителем кумасси G-250, по методу Бредфорд [21]. Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин "Sigma" (США). Содержание белка в ФП составляло 6.3%. Анализ белков, входящих в состав ФП, проводили методом электрофореза в денатурирующих условиях согласно методике [22]. Состав гелей: концентрирующий гель - 6%-ный, рН 6.8; разделяющий гель 12%-ный ПААГ, рН 8.8. Толщина геля 0.75 мм. Использовали стандарты Мм в пределах 14.4-97.0 кДа "Sigma" (США). Количество белка, вносимого на одну дорожку - 10 мкг.
Определение активности гликозидаз в ФП. Активность хитиназы, хитозаназы и целлюлазы в ФП определяли по количеству, образующихся восстанавливающих сахаров в результате ферментативного гидролиза, соответствующих полисахарид-ных субстратов, взятых в концентрации 5 мг/мл. Состав реакционной смеси: 0.5 мл субстрата, 0.5 мл раствора ФП (концентрация 1 мг/мл, по белку 0.063 мг/мл), 0.5 мл буфера (0.2 М №-аце-татный, рН 5.6—5.8). Смесь инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливали кипячением в течение 10 мин. Далее реакционную смесь центрифугировали и в супер-натанте определяли концентрацию восстанавливающих сахаров. Активность хитиназы, хитозаназы и целлюлазы выражали в мкмолях М-ацетил-О-глюкозамина, Э-глюкозамина и Э-глюкозы, образовавшихся за 1 мин, при использовании в реакции
1 мг белка ФП в условиях опыта [23].
Активность М-ацетилглюкозаминидазы ФП оценивали по количеству п-нитрофенола, образовавшегося в процессе ферментативной реакции. Состав реакционной смеси: 0.2 мл субстрата (1 мг/мл, Ма-фосфатный буфер, рН 6.5), 0.1 мл ФП. Реакционную смесь выдерживали в течение 5 мин при 37°С. Количество образовавшегося в реакции нитрофенола определяли спектрофото-метрическим методом при длине волны 400 нм, используя в расчетах молярный коэффициент экстинкции, равный 18 х 103 М-1 см-1 [24]. Активность выражали в мкмолях «-нитрофенола, образовавшегося в ходе реакции за 1 мин, при действии 1 мг белка ферментного препарата в условиях опыта.
Активность эндохитиназы в ФП определяли согласно методике, описанной в работе [25]. К
2 мл коллоидного хитина добавляли 0.5 мл ФП, смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Ферментативную реакцию останавливали охлаждением раствора до 0°С 15 мин. Об активности эндохитиназы судили по снижению оптической плотности суспензии коллоидного хитина при длине волны 700 нм до начала инкубации Д-00(0) и после Д-00(30 мин). За единицу активности эн-дохитиназы принимали уменьшение оптической плотности на 1% от начального поглощения.
Определение восстанавливающих сахаров (ВС).
Образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза хитина, хитозана и карбоксиметилцел-люлозы сахара определяли с динитросалициловым реагентом согласно методике [26]. Реакционную смесь, состоящую из 0.25 мл гидролизата, содержащего ВС, 0.25 мл 1%-ного раствора 3,5-динитроса-лициловой кислоты нагревали в течение 5 мин в кипящей водяной бане, охлаждали до комнатной температуры, после чего разбавляли дистиллированной водой до объема 2.5 мл. Оптическую плотность раствора определяли при длине волны
Влияние рН буфера (а), температуры (б) и продолжительности процесса ферментативного гидролиза (в) на высвобождение восстанавливающих сахаров. (Хитозан Мм — 1000 кДа, СД 85%; 0.3 М №-ацетатный буфер; 37°С; Ф/С = 1/800; 15 мин). а — рН 3.6—6.5; б, в — рН 5.6.
582 нм. Количество ВС, образовавшихся в результате ферментативного гидролиза, рассчитывали как количество мг ВС на 1.0 г хитина, хитозана и карбоксиметилцеллюлозы. Для построения калибровочных кривых использовали N-ацетил-Э-глюкозамин, D-глюкозамин и D-глюкозу соответственно.
Определение активности протеазы в ФП. Определение активности проводили с использованием в качестве субстрата азоказеина [27]. Одна единица активности протеазы соответствовала количеству белка в ФП, необходимому для увеличения единицы оптической плотности при длине волны 340 нм на 0.01 в 1 мин при выделении пептидов, содержащих азогруппу.
Ферментативный гидролиз хитозана. Гидролиз проводили следующим образом: 1.0 г хитозана (Мм 1000 кДа, СД 85%) растворяли в течение 1 ч в 40 мл раствора 1.0 М уксусной кислоты при перемешивании, затем добавляли 11
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.