ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 561-569
УДК 577.15
ДЕСТРУКЦИЯ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДОВ: СОЧЕТАНИЕ БИОКАТАЛИЗА И МОНИТОРИНГА ПРОДУКТОВ
© 2014 г. Е. Г. Влах*, **, М. В. Волокитина*, ***, Д. О. Виноходов***, Т. Б. Тенникова*, **
*Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004, Санкт-Петербург **Санкт-Петербургский государственный университет, Институт химии, 198584, Санкт-Петербург ***Санкт-Петербургский технологический институт (Технический университет), 190013, Санкт-Петербург
e-mail: vlakh@mail.ru Поступила в редакцию 17.02.2014 г.
На основе макропористых монолитных материалов, содержащих ковалентно связанную рибону-клеазу А созданы высокоэффективные проточные гетерогенные биокатализаторы (биореакторы). Определены кинетические параметры деструкции полицитидиловой кислоты и проведено сравнение свойств полученных систем. Разработан метод ВЭЖХ-мониторинга продуктов биокаталитической деструкции РНК, а также показана возможность использования биокаталитической и ВЭЖХ колонок в процессах деструкции РНК в многокомпонентной смеси биологических молекул.
DOI: 10.7868/S0555109914060154
Уникальные свойства ферментов, способных катализировать химические превращения в мягких условиях с высокой степенью субстратной специфичности, определили их применение во многих технологических и аналитических процессах, например в пищевой промышленности [1, 2], фармацевтической [3, 4], при создании биосенсоров [5], а также в процессах тонкого органического синтеза [6] и т.д.
В настоящее время широкое развитие генной инженерии ставит задачи получения высокоочи-щенных ДНК-продуктов, свободных, в частности, от примесей РНК. Обычно, для удаления примесей РНК из ДНК-содержащих образцов используют метод, основанный на деструкции РНК рибонуклеазами [7].
Рибонуклеаза А (РНКаза) катализирует специфическое расщепление фосфодиэфирных связей в одноцепочечных РНК и полинуклеотидах, построенных из пиримидинсодержащих нуклеоти-дов [8]. Учитывая высокую стоимость ферментов, как правило, значительно превышающую стоимость химических катализаторов, а также необходимость удаления биокатализатора из реакционной среды, более экономичным и технологичным способом проведения биокатализа является применение гетерогенных форм биокатализаторов, то есть ферментов, иммобилизованных на поверхности твердой фазы [9]. Преимущества использования гетерогенных биокатализаторов очевидны: локализация белка на поверхности носителя способствует стабилизации его конформации, препятствуя, таким образом, денатурации и снижению уровня каталитической активности, облегчает процесс отде-
ления продуктов реакции, делает возможным многократное использование биокатализатора.
В зависимости от принципа, лежащего в основе иммобилизации, существующие методы можно подразделить на две группы: физические и химические [10]. К первой группе относят адсорбцию [11], а также включение фермента в органический и неорганический гель или мембранные системы [12— 14]. В основе методов второй группы лежит кова-лентное прикрепление фермента к поверхности носителя [15—17].
Традиционной формой проточных гетерогенных биокатализаторов являются колонки, заполненные пористыми микрочастицами носителя, содержащими иммобилизованный фермент [18]. В таких системах массоперенос вещества контролируется его диффузией в поры частиц стационарной фазы. При этом количество преобразованного субстрата в продукт зависит в основном от молекулярной диффузии, размеров пор и частиц, а также скорости потока субстрата. В связи с этим для колонок, упакованных частицами сорбента, возможность использования высоких скоростей потока подвижной фазы существенно ограничена. Во-первых, это связано с тем, что при увеличении данного параметра большая часть раствора субстрата протекает в пространстве между частицами, что неизбежно приводит к ухудшению эффективности биокатализа. Во-вторых, увеличение скорости потока часто приводит к сжатию слоя сорбента, и, как следствие, увеличению давления в системе.
В отличие от упакованных колонок стационарные фазы нового поколения на основе макро-
2
561
пористых полимерных сорбентов монолитного типа представляют собой гомогенный материал с системой взаимосвязанных проточных пор. Благодаря этому, одним из основных преимуществ макропористых монолитных колонок является их высокая проницаемость и, как следствие, доминирование конвективного механизма массопе-реноса над диффузионным, имеющим место в упакованных колонках [19]. Кроме того, данные стационарные фазы характеризуются низкими значениями рабочего давления в системе, что позволяет проводить динамические процессы при высоких скоростях подвижной фазы. Среди прочих достоинств данных материалов следует отметить высокую механическую и химическую устойчивость, возможность вариации реакционных групп поверхности и, что немаловажно, простоту синтеза [20]. Изначально данный вид материалов был разработан для применения в качестве стационарных хроматографических фаз [21]. Однако преимущества монолитов оказались очень полезными для решения не только сепара-ционных, но и биокаталитических задач [22, 23].
Цель работы — получение серии гетерогенных биокатализаторов на основе макропористых по-лиметакрилатных монолитных фаз различной геометрии, содержащих иммобилизованную ри-бонуклеазу А, изучение их свойств, а также возможности сочетания биокатализа и мониторинга продуктов реакции в одном процессе.
МЕТОДИКА
Все вещества, использованные в синтезе монолитных твердых фаз, а именно, 2,3-эпокси-пропилметакрилат (глицидилметакрилат, ГМА, 97%), этилендиметакрилат (ЭДМА, 98%), 2-гид-роксиэтилметакрилат (ГЭМА, 98%), азо-бис-изобутиронитрил (АИБН), додеканол (99%), циклогексанол, толуол, а также рибонуклеаза А из бычьей поджелудочной железы (РНКаза, КФ 3.1.27.5), полицитидиловая кислота, РНК из дрожжевых клеток были производства компании '^§та-АЫйсИ" (Германия). Дигидрофосфат натрия дигидрат, гидрофосфат натрия додекагидрат, тетраборат натрия декагидрат, трис(гидроксиме-тил)аминометан, динатриевая соль ЭДТА, хлорид натрия, гидроксид натрия, боргидрид натрия, а также 25%-ный водный раствор аммиака, мочевина и соляная кислота были приобретены в "ООО "Нева-Реактив" (Россия). Буферные растворы готовились путем растворения солей в дистиллированной воде с последующей фильтрацией через 0.45 мкм мембранный микропористый фильтр МПИроге (США). Водорастворимый полимер 2-деокси-^метакрилоиламидо^-глюко-зы (пМАГ), ММ 25000, был синтезирован методом свободно-радикальной полимеризации и ча-
стично окислен до образования альдегидных групп (28 мол. %) по ранее разработанному протоколу [24].
Синтез монолитных носителей, имеющих форму стержня, проводили в специальных колонках-картриджах из нержавеющей стали длиной 50 мм и диаметром 4.6 мм, производства фирмы "Supelco" (США). Коммерчески доступные хроматографиче-ские CIM DEAE и CIM Epoxy диски (оба типа диаметром 12 мм и толщиной 3 мм), использованные для иммобилизации фермента и хроматографиче-ского анализа, были получены от компании "BIA Separations" (Словения). Хроматографиче-ский анализ продуктов и проточный вариант твердофазного биокатализа в непрерывном режиме выполнялись с использованием градиентной хро-матографической системы "Shimadzu" (США), состоящей из двух насосов LC-10AD VP и LC-20AD, УФ-детектора SPD-10AV, системного контролера SCL-10A VP и дегазатора DGU-14A. Температура колонки поддерживалась с помощью термостата ТК-50 "Eppendorf"' (Германия). Для проведения биоконверсии в режиме рециркуляции использовали насос низкого давления LKB P-1 "Pharmacia" (Швеция). Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре UVmini-1240 "Shimadzu" (Япония).
^тез полиметакрилатных монолитных колонок. Синтез полимерных носителей осуществляли методом свободнорадикальной термоиниции-руемой полимеризации мономеров непосредственно в колонке-картридже из нержавеющей стали в присутствии порообразующих веществ и инициатора. Реакционная смесь для проведения полимеризации содержала 0.48 мл ЭДМА, 0.42 мл ГМА и 0.30 мл ГЭМА (мономеры), 1.54 мл доде-канола и 0.26 мл циклогексанола (порогены), а также 0.13 г инициатора (ДИНИЗ, 1% от массы мономеров). Синтез макропористых монолитов проводили в термостате при 70°С в течение 8 ч. Полученные колонки встраивались в хромато-графическую систему и последовательно промывались при скорости потока подвижной фазы 0.5 мл/мин этанолом, смесью этанол—вода (1 : 1) и водой в течение 3 ч для удаления из порового пространства порогенов и избытка мономеров. Характеристики полученных колонок, а именно, проницаемость, пористость и средний диаметр пор, были рассчитаны, основываясь на данных гидродинамической проницаемости по методу, описанному ранее [25].
Получение гетерогенных биокатализаторов: прямая иммобилизация. Перед проведением реакции иммобилизации и колонку, и коммерческий диск уравновешивали 0.1 М Na-боратным буферным раствором, рН 9.0. Затем через носитель пропускали раствор РНКазы в 0.1 М Na-боратном буферном растворе, рН 9.0, с концентрацией 5 мг/мл со ско-
ростью потока 0.5 мл/мин. Для колонок объем пропускаемого раствора фермента составлял 3 мл. В случае дисков 1.0 мл раствора фермента пропускали сквозь диск, который далее погружали в 1.0 мл раствора фермента. Реакцию проводили в течение 20 ч при температуре 22°С. Избыток фермента удаляли последовательным промыванием полученных каталитических систем №-борат-ным буферным раствором (20 мл), 2 М №С1 (8 мл) и дистиллированной водой.
Получение гетерогенных биокатализаторов: иммобилизация фермента через макромолекулярный спейсер. Аминирование. Водный раствор аммиака (25%-ный) 10 или 5 мл пропускали через колонку или диск соответственно, со скоростью потока 0.5 мл/мин. После заполнения порового пространства носителя раствором аммиака колонку (диск) термостатировали в течение 5 ч при температуре 40°С. После завершения реакции колонку промывали дистиллированной водой.
Иммобилизация спейсера. Для ковалентного присоединения пМАГ аминированный монолитный сорбент уравновешивали 0.01 М ^-фосфатным буферным раствором (рабочий
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.