— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ —
ДЕТЕКЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК HELICOBACTER PYLORI В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
© 2007 г. В.Н. Нелюбин, В.П. Мудров*
Центральная больница № 6 ОАО «Российские Железные Дороги»; Москва, Россия; *Центральная поликлиника ОАО «Российские Железные Дороги», Москва, Россия
Поступила 26.12.06 г. Принята 20.04.07 г.
Представлены результаты обследования 77 пациентов с хроническим гастритом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Материалом для исследования служили биоптаты слизистой оболочки гастродуоденальной области, полученные при эндоскопическом обследовании пациентов, и мононуклеарные клетки периферической крови. Наличие Helicobacter pylori в биологическом материале определяли методом полимеразной цепной реакции. Обнаружен ранее неизвестный факт персистенции участков генома Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови. Исследование CD4+, CD8+, CD14+ субпопуляций мононуклеарных клеток показало различное присутствие в них фрагментов ureC, cagA, vacA генома Helicobacter pylori. Выявлена прямая зависимость между выраженностью патологического процесса в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и циркуляцией патогенных агентов в периферической крови.
Ключевые слова: патология желудочно-кишечного тракта, Helicobacter pylori, мононуклеарные клетки периферической крови
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день инфекционные болезни занимают значительное место среди причин смертности во всем мире. К тому же, если учитывать установленный факт инфекционной этиологии ряда заболеваний, ранее считавшихся соматическими (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, некоторые сердечно-сосудистые и онкологические заболевания), то инфекционная патология может занять лидирующее место в этом списке [1].
Большую проблему представляют вялотекущие хронические воспалительные процессы, связанные с персистенцией микробного агента, в том числе заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), ассоциированные с инфицированием Helicobacter pylori. Этому вопросу уделяется пристальное внимание на протяжении более чем 20 лет. H. pylori является ключевым фактором в патогенезе большинства клинически значимых нозологических форм заболеваний ЖКТ, в число которых входят: хронический гастрит, дуоденит, язвенная болезнь,
Адрес: 109388 Москва, ул. Шоссейная, д. 43. E-mail: vlnelyubin@mail.ru
MALT-лимфома желудка и другая патология. Установлено, что интенсивность воспалительной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки, в том числе лимфоцитами, четко коррелирует со степенью H. pylori-колонизации слизистой ЖКТ [2, 3].
Известно, что более чем в 90% случаев при инфицировании Helicobacter pylori с течением времени развивается хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки. Более того, на сегодняшний день существует большое количество опубликованных экспериментальных и клинических работ о внежелудочных эффектах Helicobacter pylori. В основном эти работы описывают поражение сердечно-сосудистой системы [2, 4].
К настоящему времени H. pylori относят к типичным экстрацеллюлярным патогенам. Однако большое число экспериментов in vitro и исследования биоптатов показали, что этот микроорганизм иногда способен к проникновению в нефагоцитирующие клетки хозяина, в частности, эпителиальные клетки. Эти результаты показали возможность интернали-зации H. pylori в клетки желудочного эпителия через сигналы трансдукции. Также показано, что связывание сывороточных факто-
ров с H. pylori может стимулировать внедрение его в эпителиоциты через ß1-интегрин опосредованные сигнальные пути, а H. pylori (cag+) штамм способен использовать IV-тип системы секреции, для введения бактериального белка CagA в различные типы профессиональных фагоцитов, включая полиморфно-ядерные лейкоциты человека, а также клетки макрофагальной линии THP-1 человека и крысы [2, 4, 5, 6, 7]. Опубликованные данные, свидетельствующие о наличии фрагментов ДНК H. pylori в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов, вызывают закономерный вопрос о механизме и путях попадания микроорганизма или его фрагментов в сосудистое русло.
Поскольку известно, что в местных воспалительных реакциях при инфекции, обусловленной Helicobacter pylori, активное участие принимают мигрирующие иммуноком-петентные клетки [2, 8, 9], наши усилия были направлены на исследование возможного факта персистенции микроорганизма в клетках иммунной системы, циркулирующих в кровяном русле. А так же возможной зависимости этого явления от выраженности патологического процесса в слизистой оболочке ЖКТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Всего было обследовано 77 пациентов, находившихся на диспансерном наблюдении. Диагноз ставился на основании данных осмотра, эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС), гистологического и цитологического исследований в соответствии с протоколом исследования, рекомендуемым Сиднейской системой [2].
ЭГДС проводили в утренние часы, натощак, с взятием 3 биоптатов слизистой оболочки антрального, фундального отделов желудка и двенадцатиперстной кишки. Взятие периферической крови из локтевой вены проводили в тот же день с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта.
На основании полученных данных были сформированы следующие группы пациентов: группа сравнения — 20 пациентов; группа с поверхностным воспалением — 14 пациентов; группа с деструктивным воспалением — 43 пациента.
Критерием отбора пациента в группу сравнения служили отсутствие признаков воспаления Н. pylori по данным ЭГДС, гистологии и цитологии. В группу с поверхностным воспалением вошли пациенты с диагнозом поверх-
ностный гастрит, в группу с деструктивным воспалением — пациенты с эрозивными и/или язвенными изменениями слизистой оболочки гастродуоденальной области.
Выделение ДНК H. pylori из биоптатов осуществляли наборами реагентов НПФ "ЛИ-ТЕХ", Москва, Россия. Для экстракции и очистки ДНК H. pylori кусочек ткани слизистой желудка или 12-перстной кишки помещали в 100 мкл лизирующего раствора, включающего 10 мМ Трис HCl pH = 8,8, 25 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы К, и инкубировали до полного растворения. К раствору добавляли 10 мкл водной суспензии сорбента и буфера, состоящего из 10 мМ Трис HCl рН 8,0, 5,5 М гуанидинтиоцианата 10мМ ЭДТА. Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, периодически встряхивая, после чего сорбент осаждали центрифугированием 20 секунд при 12 тыс. об/мин. Супер-натант удаляли с помощью вакуумного насоса, осадок дважды промывали 70% этанолом и высушивали при 60°C в течение 10 мин. Очищенную ДНК элюировали 50 мкл ТЕ-буфера. В качестве мишени для амплификации использовали фрагменты гена ureC, vacA, cagA, характеризующие штаммы H. pylori. Использовали праймеры (табл. 1) и коммерческие тест-системы, разработанные на базе Института общей генетики РАН, Москва, Россия (д.б.н. Шейхаев Г.О.).
ПЦР проводили в объеме 30 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мМ Трис НС1 рН 8,3, 50 мМ KCl, 2 мМ MgC12, 50 мкМ каждого дНТФ, 10 пкМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл анализируемого очищенного образца. После проведения амплификации по стандартной программе (табл. 2) продукты амплификации идентифицировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Выделение CD4+, CD8+, CD14+ из монону-клеарных клеток периферической крови, полученных на градиенте плотности р = 1,077, проводили методом иммуномагнитной сепарации с использованием готовых реактивов (Dynal, Норвегия).
Все этапы разделения проводили при температуре 2 — 8°C, во избежание неспецифического связывания иммуномагнитных частиц «Dynabeads» фагоцитирующими клетками: 1. Образцы мононуклеарных клеток, полученных на градиенте плотности, ресуспенди-ровали в ФСБ с 2% эмбриональной телячьей сывороткой до концентрации 0,5 х 107 клеток/мл буфера;
Таблица 1. Использованные праймеры H. pylori
Фрагмент генома Праймеры Размер ампликона (ПЦР-продукта), п.н.
H. pylori (ure) прямой: 5 ' -GTAAATTGAGTTCCTGGTGAGTTGTTCT-3' обратный: 5 '-GCTTTCGTTATCGGCTTGCCTATCA-3' 318
H. pylori (vacA) прямой: 5 '-CGCCTCCAATTTTACCTTTTTACAC-3' 565
обратный: 5 '-AATCCCAACCTCCATCAATCTTACT-3'
H. pylori (cagA) прямой: 5 '-GCCACTACCACCACTCACATACA -3' обратный: 5 '-AGCTCAATTCCCCATTACCAAACTC-3' 524
Таблица 2. Программа амплификации
Температура Время Количество циклов
95°C 60 сек
62°C 40 сек 1 цикл
74°C 90 сек
95°C 30 сек
60°C 30 сек 1 цикл
74°C 60 сек
95°C 20 сек
58°C 20 сек 43 цикла
74°C 40 сек
74°C 60 сек 1 цикл
2. К 0,5 мл клеточной суспензии добавляли необходимое количество иммуномагнитных частиц «Dynabeads», рассчитанное из соотношения частиц к целевым клеткам 4:1;
3. Инкубировали 20 минут в перемешивающем устройстве;
4. Пробирку помещали в магнитный штатив на 2 — 3 минуты и, не вынимая пробирки, удаляли супернатант;
5. Выделенные клетки с частицами промывали в 1,0 мл ФСБ с 2% ФТС, операцию повторяли 4 раза;
6. По окончании процесса промывки клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640 в объеме 100 мкл.
Наличие участков генома H. pylori определяли с помощью ПЦР по методике, описанной выше.
Анализ результатов исследования проводили с использованием общепринятых методов. Частоту обнаруженных явлений выражали в процентном отношении к общему числу па-
циентов в группе. Коэффициент корреляции определяли по методу ранговой корреляции Спирмена. Построение гистограмм осуществляли в программе «Microsoft Excel».
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика штаммов H. pylori, инфицирующих слизистую оболочку гастродуоде-нальной области.
Исследование биоптатов слизистой оболочки гастродуоденальной области показало высокую встречаемость штаммов H. pylori при хронических воспалительных заболеваниях с эрозивными и язвенными поражениями желудка, а так же двенадцатиперстной кишки. Были определены типы штаммов H. pylori, контаминирующих слизистую оболочку гастродуоденальной области:
• cagA-vacA- — непатогенный штамм;
• cagA+vacA- — патогенный штамм;
• cagA+vacA+ — патогенный и ульцероген-ный штамм (рис. 1).
Детекция фрагментов ureC, cagA, vacA в мононуклеарных и CD4 + , CD8+,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.