ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22
ДЕТЕКЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ СЕРНОГО МЕТАБОЛИЗМА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ЗРИЛЕЮТИШ ШТШБ SUBSP. 8иЬ¥Ю1УОВШ8
© 2013 г. Е. В. Белоусова*, Е. Ю. Черноусова* Г. А. Дубинина**, 1, Т. П. Турова**, М. Ю. Грабович*, 1
*Воронежский государственный университет **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 03.12.2012 г.
Способность к литотрофии у представителей Ве(арго(еоЬас(епа — 8рНаетШш пШапз 8иЪ8р. тЩйг-уогат, была подтверждена на генетическом уровне: обнаружены функциональные гены ферментов серного метаболизма, такие как аргВА, $охВ и sqr, кодирующие АФС-редуктазу, тиосульфатрасщеп-ляющий комплекс и сульфид-хинон оксидоредуктазу; показана экспрессия генов аргА и дахВ. На основании сравнительного анализа частоты использования кодонов, топологии филогенетических деревьев и нуклеотидного состава ДНК (Г + Ц состав) предложен сценарий эволюции генов $охВ у представителей рода 8ркаегоШш. Предковая бактерия группы 8ркаегоШт—ЬерШкгчх, обладала способностью к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы, но в процессе дальнейшей эволюции, гены серного метаболизма, и в частности ген $охВ, были утеряны у некоторых штаммов 8ркаегоШш. В результате литотрофная группа 8ркаегоШы$—ЬерШкгчх разделилась на две физиологические линии — литотрофные и органотрофные бактерии.
Ключевые слова: литотрофия, 8ркаегоШы$ па(ат 8иЪ8р. sыlfidivoгans, экспрессия генов, эволюция.
DOI: 10.7868/S0026365613050029
Сероводородные источники Северного Кавказа характеризуются уникальным набором условий окружающей среды: наличием органических субстратов, умеренно высокими температурами (30—40°С), постоянным притоком сероводорода, что способствует развитию сообществ сероокис-ляющих прокариот. Впервые представители рода Sphaerotilus, ранее считавшиеся типичными гете-ротрофами, были нами обнаружены в составе доминирующих компонентов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных умеренно-термальных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона [1—3] и был описан новый подвид Sphaerotilus natans sub-sp. sulfidivorans [4]. Представители нового подвида способны к литотрофному росту при окислении восстановленных соединений серы. У этих бактерий была обнаружена активность АФС-редуктазы и сульфит-оксидоредуктазы.
Однако для представителей S. natans subsp. sulfidivorans до сих пор нет полной картины ферментативных путей превращений восстановленных соединений серы. Неясно, какие ферментные системы участвуют в окислении тиосульфата, сульфида, элементной серы.
1 Авторы для корреспонденции: (e-mail: margarita_ grabov@mail.ru, gdubinina@mail.ru).
Как известно, энзиматические пути, используемые прокариотами для диссимиляционного окисления соединений серы являются широко вариабельными [5, 6]. Окисление сульфида часто осуществляется посредством работы широко распространенного фермента сульфид :хинон окси-доредуктазы (SQR), кодируемого геном sqr [7]. Накоплены экспериментальные данные, показывающие, что обратная диссимиляционная суль-фитоксидоредуктаза (rDsr) играет значительную роль в процессах окисления сульфида или элементной серы до сульфита [8]. Последующее окисление сульфита до сульфата может быть опосредовано двумя различными ферментными системами. Работа первой системы не сопряжена с функционированием электронтраспортной цепи, АТФ синтезируется за счет субстратного фосфори-лирования: АФС-редуктаза (гены aprBA) катализирует связывание сульфита с АМФ, в результате чего образуется АФС, который под действием или АТФ-сульфурилазы (Sat) или аденилилсульфат: фосфат аденилилтрансферазы (APAT) превращается в сульфат. Работа второй системы сопряжена с функционированием ЭТЦ, АТФ синтезируется за счет окислительного фосфорилирования: сульфит окисляется при участии сульфит: акцептор оксидоредуктазы, катализирующей АМФ-независомое окисление его до сульфата [5, 9].
579
5*
Праймеры, использованные в работе
Название праймера 5' — 3' последовательность Специфичность
AprB-1-FW TGC GTG TAY ATH TGY CC aprBA [7]
AprA-5-RV GCG CCA ACY GGR CCR TA
AprA-1-FW TGG CAG ATC ATG ATY MAY GG
693F ATC GGN CAR GCN TTY CCN TA soxB [6]
1446B CAT GTC NCC NCC RTG YTG
1164F AAR TTN CCN CGN CGR TA
432F GAY GGN GGN GAY ACN TGG
G3-199F TBT AYS AGC CGG GWC TKC TBT sqr [8]
G3-566R GGY GCM ACS GGG CAT TTG
Помимо сульфида и серы в качестве донора электронов многие литотрофные сероокисляю-щие прокариоты способны использовать тиосульфат [5, 10, 11]. Можно выделить несколько различных ферментных систем и путей, участвующих в диссимиляционном окислении тиосульфата [5, 6, 10]: 1) окисление тиосульфата через по-литионат ферментами тиосульфат дегидрогена-зой и тетратионат гидролазой [10]; 2) окисление под действием периплазматического ферментного комплекса 8ох, до сульфата с или без формирования серных глобул.
Для бактерий Б. na.ta.ns 8иЪ8р. зиЩйыогат остается открытым вопрос о путях превращения сульфида и тиосульфата, которые используются ими для литотрофного роста. Поскольку с использованием биохимической методологии определение активности ферментов, участвующих в этих процессах, вызывает определенные трудности, то определение генов, кодирующих эти ферменты, и уровень их экспрессии позволят внести ясность в решение этого вопроса.
В связи с этим целью настоящей работы было выявление генов, кодирующих ферменты серного метаболизма, у штаммов Б. natans 8иЪ8р. sulfidi-\orans, способных к литотрофии, а также определение уровня их экспрессии в аэробных и микроаэробных условиях роста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и методы культивирования. В работе использовали штаммы Д-501 и Д-507 Б. natans БиЪзр. sulfidivorans, выделенные из микробных сообществ сероокисляющих бактерий из умеренно термального сульфидного источника "Петушок" (г. Горячий Ключ Краснодарского края). Бактерии культивировали в аэробных и микроаэробных условиях [4].
Выделение суммарной клеточной фракции РНК.
Суммарную фракцию клеточной РНК выделяли, как описано в [12]. Качество полученной РНК контролировали электрофоретически в денатурирующем полиакриламидном геле (4% ПААГ с 8 М мочевиной). Концентрацию препаратов определяли на спектрофотометре ND-1000.
Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции). Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы изготовителя ("Fermentas"). Смесь РНК (2 мкг) с соответствующим праймером (4 пмоль) "плавили" в течение 10 мин при 68°С, добавляли master mix, содержащий буфер для ревертазы (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2 и 50 mM DTT), dNTP (конечная концентрация в пробе — 0.2 mM), и ингибитор рибону-клеаз. Затем пробирки быстро охлаждали на льду, добавляли 40 ед. обратной транскриптазы MMulV (Revert AidTM) и проводили реакцию при 42°С в течение 40 мин. Для инактивации фермента пробы прогревали 5 мин при 85°С.
Полимеразная цепная реакция. Для обнаружения генов soxB, aprBA, sqr были использованы вырожденные праймеры (табл. 1). ПЦР проводили в 10 мкл смеси, содержащей: 0.6 мкл 10 pM прайме-ра, 1.2 мкл (около 50 нг) очищенного ПЦР продукта, 2.2 мкл деионизированной воды и 6 мкл стандартного набора CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit ("Beckman Coulter", США). Амплификация участков данных генов, была проведена согласно [13, 14,15].
Количественную ПЦР участков генов soxB и aprBA проводили на приборе ДТ-322 "ДНК-Технология", Россия с использованием интеркалиру-ющего в двухцепочечную ДНК красителя SYBR Green I "Invitrogen", США. Для амплификации кДНК использовали следующую программу: 94°С, 1 мин (1 цикл) — предварительное плавление кДНК с праймерами. Далее 40 циклов по про-
грамме: 94°С - 20 с (плавление кДНК); 48-52°С -23 с (отжиг праймеров); 72°С — 50 с (синтез фрагмента ДНК). Температура отжига подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров. В случае генов aprBA была использована технология touch-down ПЦР, когда в течение первых 8—10 циклов температура отжига постепенно снижается от максимальной, приемлемой для данной пары (60°С), на 5—6 градусов, а затем оставшиеся 30 циклов проводятся по стандартной программе. Оценку флуоресцентного сигнала осуществляли в конце каждого цикла в течение 15 с. Эксперименты проводили на двух независимых препаратах РНК в трех статистических повторностях. Во всех случаях качество ПЦР-продуктов оценивали электрофоретически в 5%-ом ПААГ (210 В, 100 мА). В качестве маркеров молекулярного веса использовали стандартный набор фрагментов ДНК (New England Biolabs, Quick-Load™ 100bp DNA Ladder). Количественный анализ уровня экспрессии генов проводили при помощи программы q_PCR "ДНК-Технология". Относительное количество синтезированных ампликонов рассчитывали по формуле 2ACt [16].
Определение нуклеотидной последовательности участков генов проводили на автоматическом се-квенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом в ВНТК "Генная активность" ИБФМ РАН.
Первичный анализ сходства полученных нук-леотидных последовательностей генов проводили с помощью программ BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), ClustalW2 (http:// www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2/) и TCoffee (http://tcoffee.crg.cat/).
Филогенетический анализ. Для выяснения возможного участия гена soxB в горизонтальном переносе в группе Sphaerotilus—Leucothrix нуклео-тидные последовательности генов 16S рРНК и soxB сравнивали с последовательностями известных штаммов по рибосомальной базе данных (RDBII — http://rdp.cme.msu.edu) и банка генов национального центра биологической информации (NCBI — http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Последовательности 16S рРНК выравнивали с помощью программы CLUSTALW [17]. Построение филогенетических дендрограмм проводили с использованием программного пакета Treecon [18]. Расчет относительных частот использования кодонов и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ Codon W (http://codonw.sourceforge.net/). Содержание Г + Ц пар в ДНК генов soxB рассчитывали при помощи программы jPhydit (http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/ jphydit/). Статистическую достоверность полу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.