БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.3, c.394-399
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ДЕЙСТВИЕ НИТРОПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА C60 НА АМИЛОИДНЫЕ ФИБРИЛЛЫ Ав(1-42)-ПЕПТИДА МОЗГА И МЫШЕЧНОГО Х-БЕЛКА
© 2010 г. А.Г. Бобылёв*, Л.Г. Марсагишвили*, М.Д. Шпагина*, В.С. Романова**,
Р.А. Котельникова***, З.А. Подлубная* ****
*Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области;
**Учреждение Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А .Н. Несмеянова
РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 28;
***Учреждение Российской академии наук Институт проблем химической физики РАН, 142432, Черноголовка Московской области; ****Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области
E-mail: bobylev7@rambler.ru Поступила в p едакцию 22.03.10 г.
C помощью высокоразрешающей электронной микроскопии в in vitro амилоидных системах ЛР(1-42)-пептида мозга и мышечного X-белка семейства тайтина изучена антиамилоидная способность нитр опроизводных фуллерена Сбо: метилового эфира Ь-ИЧ-[(2-нитр оглицерил)фул-леренил]пролина, метилового эфира Ь-1-[(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролина и 2-нит-р оксиэтилового эфир а Ь-Ш-{[2-(нитрокси)этил]фуллеренил}пр олина. Обнаружена способность нитропр оизводных фуллерена Сбо предотвр ащать образование амилоидных фибрилл АР(1-42)-пептидом мозга и X-белком, а также разрушать уже сформированные ими амилоидные структур ы. Электр онная микроскопия является перспективным методом для отбор а эффективных антиамилоидных препаратов. Обнаруженная антиамилоидная активность наноразмер-ных нитр опроизводных фуллерена Сбо откр ывает перспективы для р азработки на их о снове тер апевтических подходов к лечению амилоидозов.
Ключевые слова: амилоиды, мышечный X-белок, А fi-пептиды, фуллерены, амилоидозы, болезнь Альцгеймера.
Амилоидные отложения - основной признак амилоидозов, конформационных болезней человека и животных, наступающих в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белка [1]. Накопление амилоидных депозитов разрушает структуру органов и тканей, приводя к летальному исходу. Выяснение молекулярных механизмов амилои-дозов человека и животных является одной из важнейших медико-биологических и социально-экономических проблем. Одним из эффективных подходов к решению этой проблемы является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, и их различий, установление факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность клеток и т.д.
Известно около 30 белков, образующих амилоидные фибриллы и участвующих в патогенезе
амилоидозов. Ранее нами были открыты амилоидные свойства у мышечных белков семейства тайтина (тайтин, X-, С-, Н-белки) и показана их способность легко образовывать амилоидные фибр иллы, поскольку изначально они содержат ~90% Р-складчатой стр уктуры, необходимой для формирования амилоидов [2]. П ри электронно-микроскопическом сравнении амилоидных фибрилл Х-белка и АР-пептидов мозга было обнаружено их структурное сходство [3] и высказано предположение о возможности сходных подходов к разр ушению их амилоидов и/или предотвращению их образования. Ранее методом электронной микроскопии нами была впервые продемонстрирована способность гид-ратированного фуллерена С60 (С60 ИуБп) разрушать амилоидные фибриллы Х-белка и АР-пептидов и предотвращать образование новых амилоидных фибрилл [4-14]. Было показано
ДЕЙ СТВИЕ НИТРОПРОИЗВОДНЫ X ФУЛЛЕРЕНА C6Ü
395
также, что раствор имая в воде натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена C60Cl(C6H4CH2COONa)5 способна разрушать амилоидные фибриллы X-белка и А ß(1-42)-пеп-тида и предотвращать их образование [13-15]. Антиамилоидное действие показано и для водорастворимого комплекса фуллерена C6o с по-ливинилпирролидоном (^оПВП) (м.в. ПВП 25000 и 10000) на амилоидные фибриллы мышечного X-белка и Аß(25-35)-пептида мозга [14,16]. В данной р аботе пр едставлены р езуль-таты тестирования антиамилоидных эффектов на фибр иллы X-белка и Аß(1-42)-пептида новых растворимых в воде нитропроизводных фулле-рена C6o^ метилового эфира Ь^-[(2-нитрогли-церил)фуллеренил]пролина, метилового эфира Ь^-[(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролина, 2-нитроксиэтилового эфира Ь^-{[2-(нитрокси)этил]фул-леренил }пролина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение мышечного амилоидного X-белка.
X-белок семейства тайтина был изолирован из скелетных мышц кролика по методу, описанному в работе [17]. Чистота препаратов X-белка была тестир ована ДCН -гель-электрофор езом по методу [18] с некоторыми модификациями, улучшающими фокусирование белковых полос в геле. Концентрация белка была определена с помощью спектрофотометр а Зресогё UV VIS, с использованием для X-белка коэффициента экстинкции Е^ 1,09 [19].
Образование амилоидных фибрилл X-белка и АР(1-42)-пептида. Фибриллы X-белка были сфор мированы диализом против раствор ов, содержащих 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7,0 в течение 24 ч при 4 и 37°C. И спользовали Aß^^y^m^ фирмы Sigma-Aldr^ ^ША). Формирование амилоидных фибр илл Aß(1-42)-пептидом было проведено в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7,0 в течение 24 ч пр и 37°C. Амилоидную природу фибрилл тестировали спектрофотометрически по связыванию их с кр асителями Конго кр ас-ным и тиофлавином Т с помощью спектрофотометра CARY 100, Varían и спектрофлуори-метра CARY ЕсНр8е, Varían.
Электронная микроскопия. Капля суспензии белка с концентрацией 0,1 мг/мл была нанесена на покрытую углем коллодиевую пленку на медной сеточке и негативно окрашена 2%-м водным раствором уранилацетата [20]. Образцы просматривали на электронных микроскопах
JEM-100B и LIBRA 120 при увеличении 40000Х. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с осевой периодичностью 14,5 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для разработки эффективных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых X-белком семейства тайтина и АР(1-42)-пептидом мозга, было проведено электронно-микроскопическое изучение антиамилоидного эффекта нит-ропроизводных фуллерена С60 (рис. 1).
В настоящее время фуллерены рассматриваются как потенциальные лекарственные на-нопрепараты [21], в том числе и для лечения нейродегенеративных болезней. Гидрофоб-ность, сферическая форма молекулы, редокс-свойства, низкая токсичность, проницаемость через модельные липидные мембраны стимулируют исследования антиамилоидных свойств фуллерена Сб0 [22-24]. Обнаружение нами антиамилоидной активности фуллерена Сб0 и некоторых его производных методом электронной микроскопии позволило подтвердить выдвинутое ранее предположение о возможности использования сходных подходов к р азрушению амилоидов X-белка семейства тайтина и АР-пептидов мозга [6-10,12-14]. Результаты проведенных экспериментов показали также, что введение в мозг кр ысам Сб0 HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме [5]. В экспериментах по исследованию токсического действия амилоидов мышечного X-белка на культуру полиморфно-ядерных лейкоцитов было выявлено, что в присутствии гидратирован-ного фуллерена Сб0 выживаемость клеток при добавлении в культуру фибрилл X-белка была выше, чем при добавлении амилоидов этого белка без Сб0 HyFn. Эти результаты свидетельствуют не только о разрушающем действии фуллер ена Сб0, но и об отсутствии токсичности Сб0 HyFn [6]. Однако применению фуллерена Сб0 препятствует его низкая растворимость в воде, поэтому усилия ученых были направлены на синтез его водорастворимых производных.
Мы провели in vitro тестирование действия метилового эфир а L-N-[(2-нитpоглицеp ил)фул-леренил]пролина (рис. 1а,б) на амилоидные фибриллы мышечного X-белка и А Р(1-42)-пеп-тида мозга (рис. 2а,б). Добавление этого производного фуллер ена Сб0 к амилоидам X-белка пр иводило к снижению количества его амилоидных фибр илл относительно контроля, а также
Рис. 1. Нитропроизводные фуллерена Сбо. (а, б) - Метиловый эфир Ь-К-[(2-нитроглицерил)фуллеренил]пролина; (в, г) - метиловый эфир Ь-1Ч-[(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролина; (д, е) - 2-нитроксиэтиловый эфир Ь-К-{[2-(нитрокси) этил]фуллеренил}пролина. (а, в, д) - Структурная формула; (б, г, е) - электронно-микроскопические снимки. Негативное окрашивание 2%-м водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.
к уменьшению их длины и ширины (рис. 3г). Это производное оказывало разр ушающее действие также на амилоидные фибриллы АР(1-42)-пептида (рис. 3б). Важно отметить что добавление данного производного фуллерена Сб0 к Х-белку и АР(1-42)-пептиду до фор мирования ими амилоидных фибрилл предотвращало образование амилоидов данным белком и пептидом (рис. 3а,в). Аналогичный антиамилоидный эффект был показан для метилового эфира Ь-К [(2,3-динитроглицерил)фуллеренил]пролина (рис. 1в,г). Это производное фуллерена С60 оказывало разрушающее действие на зрелые амилоидные фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида (рис. 4б,г) и предотвращало образование ими амилоидов (рис. 4а,в). При исследовании антиами-
лоидной активности 2-нитроксиэтилового эфира Ь-К - {[2-(нитрокси)этил]фуллеренил }пролина выявлена свойственная двум другим нитропро-изводным фуллерена Сб0 способность разрушать зрелые амилоидные фибр иллы Х-белка и АР(1-42)-пептида, а также предотвращать образование новых амилоидных фибрилл (данные не показаны).
Полученные данные позволяют рассматривать исследованные производные фуллерена Сб0 в качестве потенциальных лекарственных нано-препаратов в терапии амилоидозов и, в частности, болезни Альцгеймера. Электронно-микроскопический метод является наиболее эффективным для оценки способности разных препаратов
ДЕЙ СТВИЕ НИТРОПРОИЗВОДНЫ X ФУЛЛЕРЕНА Сб0
397
Рис. 2. Амилоидные фибриллы Aß(1-42)-nem^a (а) и X-белка (б), сформированные в 30 мМ KCl, 10 мМ имидазоле, рН 7,0. Негативное окрашивание 2%-м водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.
Рис 3. Электронные микрофотографии: АР(1-42)-пептид в присутствии метилового эфира Ь-1Ч-[(2-нитроглице-рил)фуллеренил]пролина до (а) и после (б) формирования амилоидных фибрилл. Х-белок в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.