БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, с.886-893
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3; 577.4.47; 591.42.423-424
ДЕЙСТВИЕ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ИОНОВ ВОЗДУХА НА ОРГАНЫ
ДЫХАНИЯ И КРОВЬ
© 2008 г. Т.В. Сирота*, В.Г. Сафронова, А.Г. Амелина, В.Н. Мальцева, Н.В. Авхачева, А.Д. Софин, В.А. Янин, Э.К. Мубаракшина, Л.К. Романова**, В.И. Новоселов
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская 3;
*Институт теоретической и экспериментальной биофизика РАН, 142290, Пущино Московской области,
ул. Институтская 3;
E-mail: sirotatv@rambler.ru **Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, 117418, Москва, ул. Цюрупы, 3
Поступила в p едакцию 30.11.07 г.
И сследовано влияние вдыхания кр ысами ионизированного воздуха, в котором концентр ация отрицательно заряженных ионов в месте нахождения животных составляла 320 - 350 тыс. ионов/см . Показано, что вдыхание отрицательных аэроионов в течение 60 мин вызывало активацию секреции бокаловидных клеток без повреждения слизистой трахеи и изменения белкового спектр а бронхоальвеоляр ного смыва. Установлено также, что после действия отрицательных аэроионов уровень спонтанной продукции активных форм кислорода клетками нефракционир ованной кр ови повышался как у самцов, так и у самок, пр и этом интенсивность их генер ации, индуцированной опсонизированным зимозаном, увеличивалась только у самок. Выявлена разная чувствительность антиоксидантных ферментов крови супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы к действию отрицательных аэроионов у самок и самцов. Полученные результаты позволяют интерпретировать действие отрицательных аэроионов на органы дыхания и кровь как праймирование и слабую активацию через непосредственное воздействие на слизистую первичных органов-мишеней воздухоносных путей и далее на кровь.
Ключевые слова: аэроионы, супероксид, слизистая трахеи, бронхоальвеолярный смыв, супероксид-дисмутаза, глутатионредуктаза, хемилюминесценция.
Такой фактор физической ср еды, как пр и-сутствие в воздухе, которым мы дышим, отр и-цательно заряженных ионов, названных А.Л. Чижевским аэроионы [1], является необходимым условием поддержания жизненно важных функций организма. Описанные А .И. Чижевским опыты доктора И. И. Кияницына, поставленные на большом экспериментальном материале (84 разных животных: голуби, крысы, кролики, морские свинки, собаки) и проведенные самим А.И. Чижевским эксперименты на крысах, показали, что в нормальном, но профильтрованном воздухе, лишенном отрицательных зарядов, животные погибали [2]. Эти опыты, воспроизведенные в современны х условиях [3], подтвердили жизненную необходимость отрицательных аэроионов (ОАИ). Недостаток ОАИ во вдыхаемом воздухе вызывает быструю
Сокращения: ОАИ - отрицательные аэроионы, БАС -бронхоальвеолярный смыв, АФК - активные формы кислорода, СОД - супероксиддисмутаза, ГР - глутатионредуктаза.
утомляемость, а длительное и постоянное пребывание в таких условиях может инициировать патологический процесс [4]. Было показано, что активным компонентом ОАИ является супероксид анион - экзогенный супероксид воздуха [5-8]. Отрицательно заряженные ионы постоянно присутствуют в чистом природном воздухе за счет естественных источников ионизации (космические лучи и радиационный фон почв и воздуха), а также генерации их растениями, падающей водой (водопады, дожди) и т. д.
В литературе уже не о спаривается тот факт, что эндогенные активные формы кислорода (АФК), постоянно образующиеся в процессе метаболизма клетки, являются естественными и необходимыми компонентами внутренней среды организма, их уровень контролируется системой антиоксидантной защиты и не допускается их избыток. Нарушение баланса между пр одукцией и утилизацией АФК является предпосылкой развития патологии в организме. Важен также, вероятно, и определенный баланс между внутренними АФК и отрицательно за-
ряженными ионами природного воздуха, которым мы дышим. В терапевтических целях используются более высокие концентр ации ОАИ по сравнению с их содержанием в природном воздухе [9,10]; в этом случае ОАИ создаются специальными пр иборами, названными ионизаторами воздуха. Первый такой ионизатор был создан А.Л. Чижевским. Современные подобные сертифицир ованные приборы выпускаются как в нашей стране (предприятие «Диод», Москва; медтехника [9,10]), так и за рубежом [11].
В проведенных ранее исследованиях мы использовали приборы для ионизации воздуха с разными техническими характеристиками, пр и-меняли разные дозы ОАИ и наблюдали как активирующее, так и повреждающее действие ОАИ на слизистую трахеи крыс [12]. Было показано, что вдыхание ионизированного воздуха, воздействуя на слизистую трахеи и ее антиоксидантные ферменты, распространяет свое влияние и на кровь. Клетки крови реагировали на вдыхание животными ОАИ, направленность их р еакции зависела от дозы воздействия и используемого источника генерации ОАИ [12].
Настоящая работа является продолжением наших исследований действия вдыхания животными ионизированного воздуха на органы дыхания и кровь. В данной работе изучали не только состояние слизистой трахеи крыс и кислород-зависимую фагоцитарную активность клеток крови, как это проводилось ранее, но и активность антиоксидантных фер ментов крови - супер оксиддисмутазы (СОД) и глутатион-редуктазы (ГР), а также анализировали брон-хоальвеоляр ный смыв (БАС). И сследование состава БАС может дать ответ на давно волнующий исследователей вопро с: доходят ли до легочных альвеол вдыхаемые ОАИ или реализация их действия происходит на уровне носоглотки и/или трахеи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и условия проведения экспериментов. Эксперименты проводили на 36 крысах линии Вистар массой 220 - 240 г. Были сформированы две группы животных: 1) для получения БАС; 2) для исследования со стояния тр а-хеи и крови. В каждой из групп были исследованы контрольные (без воздействия ОАИ) и опытные животные, как самки, так и самцы. Животных помещали на 60 мин в определенное место комнаты в деревянном ящике, прикрытом деревянной решеткой, где измеряемое с помощью аспираторного счетчика иТ-8401 (Тарту, Эстония) содержание легких ОАИ составляло
320 - 350 тыс. ионов/см3. После воздействия ОАИ крысы находились вне ионизатора в течение 60 мин и далее использовались для исследования. В качестве источника ОАИ применяли электроэффлювиальный аппарат аэроио-нопрофилактики «Элион 132Ш» («шарик»), разработанный предприятием ОАО «Диод» (Москва). Импульсный ионный ток - 23,0 ± 6,9 мкА, напряжение на ионизирующем электроде (пиковое значение) - минус 30,0 ± 4,5 кВ.
Гистологические исследования трахеи. У
анестезированных с помощью диэтилбарбиту-ровой кислоты животных выделяли трахею. Фиксацию материала и все последующие процедур ы проводили, как описано ранее [13]. Для приготовления срезов брали срединную часть тр ахеи. Толщина ср езов составляла 1 мкм. Окрашивание проводили фуксином и метилено-вым синим [13].
Бронхоальвеолярный смыв у животных, находящихся под наркозом, получали по методу, разработанному в лаборатории пульмонологии НИИ морфологии человека РАМН [14]. И сследование клеточного состава БАС проводили с использованием светового микроскопа в камере Гор яева после окрашивания 1% р аствор ом тр и-панового синего при увеличении х1000. Также готовили монослойные цитологические препараты, которые красили по Романовскому-Гим-за.
Хроматографическое разделение белков БАС с помощью хроматографа высокого разрешения.
БАС центрифугировали пр и 20000 g. Полученный супернатант фильтровали чер ез целлюлозные фильтры (0,22 мкм), диализировали против буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,4) и анализировали на хр оматографе высокого разрешения (HPLC) Merk-Hitadii LaChrom L 7400. Колонка - Nudeosil 4000-7 PEI, элюция 20 мМ трис-НCl буфером рН 7,4, градиент NaCl 0 - 0,6 М.
Интенсивность генерации активных форм кислорода клетками нефракционированной крови оценивали по люминол-зависимой хемилю-минесценции, как это было описано ранее для крови человека [15]. Кровь забирали с использованием гепарина из перикардиальной полости анестезированных крыс. Измерения проводили пр и 37° C в среде следующего состава (в мМ): NaCl 138, KCl 6, CaCl2 1, MgSO4 1, NaHCO3 5, Na2HPO4 1, глюкоза 5,5, люминол 0,35, HEPES 10,0, рН 7,4. Измеряли спонтанный уровень генер ации АФК, затем клетки активировали опсонизированным зимозаном (0,25 мг/мл) и регистрировали ответ в течение 20 - 25 мин. Опсонизацию зимозана проводили в плазме крови, собранной от 20 крыс. Для измерения
(а)
Рис. 1. Влияние вдыхания ОАИ в течение 60 мин в концентрации 320 - 350 тыс. ионов/см3 на слизистый эпителий трахеи крыс: (а) - интактная трахея; (б) - после воздействия ОАИ. Окраска фуксином и метиленовым синим. Шкала 10 мкм.
хемилюминесценции использовали 12-ячеечный хемилюминометр ХЕМИЛЮМ-12, разработанный Б .Ф. Санталовым (Лаборатория клеточной нейробиологии ИБК РАН, г. Пущино).
Оценка способности клеток БАС генерировать АФК проведена также по люминол-зави-симой хемилюминесценции. Осажденные центр ифугированием клетки БАС ресуспендир ова-ли в среде без добавления Са2+, суспензию распределяли по ячейкам для измерений так, что плотность клеток со ставляла 106 клеток/мл. Регистрировали базовый уровень хемилюминес-ценции (спонтанная продукция АФК), затем добавляли активирующий агент 1 мкМ форбол 12-миристат 13-ацетат (ФМА) или 50 мкМ хе-мотаксический пептид N-фор мил-Мет-Лей-Фен.
Активность антиоксидантных ферментов ге-молизата цельной крови. Активность суперок-сиддисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы (ГР) определяли соответствующими спектрофото-метрическими методами, используя спектрофотометр Uvikon 923 (Италия) в режиме time Driver. Для опр еделения С ОД применяли супер оксидгенерирующую систему аутоокисления адреналина; детектирование образующегося ад-рено хрома проводили при длине волны 347 нм в 0,2 M карбонатном буфере, рН 10,5, при 21°
С, добавляя 0,26 мМ адреналина [16,17]. Активность фермента оценивали по способности гемолизата кр ови ингибир овать генерацию супер оксидных радикалов. В пробу вносили 20 мкл гемолизата (0,8 мкл цельной крови). Активность ГР опр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.