РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), № 2, с. 139-143
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ —
ДЕЙСТВИЕ АКТГ(11-24) и АКТГ-ПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИММУНОКОРТИНА И ЛЕЙКОКОРТИКОТРОПИНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ Т- и В-ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ
КРЫСЫ IN VITRO
© 2007 г. В.И. Ванина, Н.В. Малкова, Ю.А. Ковалицкая, А.А. Колобов*, Е.А. Кампе-Немм*, В.М. Липкин, Е.В. Наволоцкая
Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино Московской обл., Россия; *ГНЦИнститут особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия
Поступила: 04.02.07 г. Принята: 02.04.07 г.
Было изучено влияние АКТГ(11-24) и АКТГ-подобных пептидов иммунокортина и лейко-кортикотропина на пролиферацию Т- и B-лимфоцитов селезенки крысы in vitro. Установлено, что ни АКТГ(11-24), ни лейкокортикотропин не оказывали влияния на включение [метил-3Н]тимидина в Т- и B-клетки. Иммунокортин, напротив, увеличивал пролиферацию как Т-, так и B-лимфоцитов. Действие этого пептида на включение [метил-3Н]тими-дина в лимфоциты селезенки ингибировали АКТГ(11-24) и лейкокортикотропин. Учитывая то, что АКТГ(11-24) это «адресный фрагмент» АКТГ, который отвечает за взаимодействие гормона с рецептором, можно предположить, что стимулирующее действие иммунокортина на Т- и B-лимфоциты селезенки крысы опосредовано через АКТГ рецептор.
Ключевые слова: АКТГ, пептиды, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, пролиферация
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время появляется все больше доказательств двунаправленного взаимодействия между иммунной и нервной системами, которые используют одни и те же сигнальные молекулы и их рецепторы в качестве общего химического языка [1]. Установлено, что АКТГ — регулятор продукции кортикостерои-дов надпочечниками, увеличивает пролиферацию Т- и В-лимфоцитов [2], а также индуцирует дифференцировку В-клеток [3, 4]. Действие АКТГ осуществляется через собственный рецептор, обнаруженный на Т- и В-лимфоцитах крысы [5, 6]. Взаимодействие между гормоном и рецептором приводит к активации аденилат-циклазной системы [7]. Более того, известно, что в лимфоцитах и макрофагах экпрессирует-ся ген проопиомеланокортина, синтезируется и высвобождается АКТГ [8].
Настоящая работа посвящена изучению действия АКТГ(11-24) и АКТГ-подобных пептидов
Адрес: 142290 Пущино, Московская обл., пр. Науки, 6, ФИБХ РАН. E-mail: navolots@fibkh.serpukhov.su
иммунокортина и лейкокортикотропина на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов селезенки крысы in vitro. Оба пептида имеют структуру, гомологичную АКТГ. АКТГ-подобные последовательности были обнаружены в вариабельной части тяжелой цепи IgG человека [9] и позже, в про-интерлейкине-1а человека [10]. Было установлено, что оба пептида связываются с АКТГ-рецептором, обнаруженным на перито-неальных макрофагах мыши, взаимодействие между пептидами и рецептором приводит к активации аденилатциклазы и увеличению содержания внутриклеточного цАМФ [10, 11].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пептиды
Пептиды АКТГ(11-24), иммунокортин (VKKPGSSVKV) и лейкокортикотропин (GKVLKKRR) были синтезированы стандартным твердофазным методом. Очистку пептидов проводили с помощью ВЭЖХ, молекулярную массу пептидов определяли с помощью масс-спектрометрического анализа. Чистота полученных пептидов превышала 95%.
Клеточные культуры
Свежую суспензию лимфоцитов получали перед каждым экспериментом из селезенок самцов и самок крыс линии SD, весом 170 — 190 г. Крысы содержались в питомнике Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Для разделения лимфоцитов суспензию клеток центрифугировали в градиенте плотности фиккол/верографин согласно стандартной методике [12]. В работе использовали конканавалин А (Кон А) для стимуляции пролиферации T-лимфоцитов селезенки (5 мг/мл) (ICN, USA). Пролиферацию B-клеток индуцировали липополисахаридом Salmonella tiphi (ЛПС) (20 мг/мл) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАН).
10"10 10"9 10"8 10"7 10"6 [иммунокортин], м
10"5
Рис. 1. Влияние иммунокортина на пролиферацию Кон А-стимулированных Т-лимфоцитов селезенки крысы. Приведены средние значения ±SEM трех независимых экспериментов
Оценка пролиферации лимфоцитов по включению [метил-3Н]тимидина
Лимфоциты селезнки крысы (1 х 106 клеток/мл) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% инактивированную эмбриональную сыворотку теленка (FBS), 25 мМ Hepes, 2 мМ L-глютамина и 50 мг/мл гентами-цина в 24-луночных планшетах для культивирования (Nunclon, Denmark) в течение 72 часов при 37°C в С02-инкубаторе. За 10 часов до окончания срока культивирования в каждую лунку добавляли 1 мкКи [метил-3Н]тимидина. По окончании инкубации содержимое каждой лунки переносили на стекловолокнистый фильтр GF/С (Whatman, Англия) и промывали 15-кратным объемом охлажденного физиологического раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика (Beckman, США). Включение [метил-3Н]тими-дина рассчитывали по формуле:
Доля включения [метил-3Н]тимидина = = (имп/мин в опыте)/(имп/мин в контроле).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel MS 2000. В статье приведены данные трех независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 видно, что иммунокортин в диапазоне концентрации 10-7—10-5 М увеличивает пролиферацию лимфоцитов селезенки крысы, стимулированных Кон А. Действие иммунокортина было дозозависимым, максимальный эффект наблюдался при концентра-
25000-
контроль контрольЮ-7 м КГ6 м 10"7м КГ'м 10~7м МГ^м + Кон А иммунокортин иммунокортин иммунокортин
АКТГ (11-24)
Лейкокор-тикотропин
Рис. 2. Влияние АКТГ(11-24) и лейкокортикотропина на способность иммунокортина стимулировать пролиферацию Кон А активированных Т-лимфоцитов селезенки крысы in vitro. Черный столбик отражает уровень включения [метил-3Н]тимидина в клетки контрольной группы; белый столбик — тот же параметр в присутствии Кон А. Светло-серый столбик отражает уровень пролиферации клеток в присутствии 10-7и 10-6М иммунокортина; серый — те же параметры в присутствии 10-4М АКТГ(11-24), темно-серый — те же параметры в присутствии 10-4 М лейкокортикотропина. Приведены данные одного из двух независимых экспериментов
ции пептида 10-5 М. Однако, протестированные параллельно АКТГ(11-24) и лейкокорти-котропин не оказывали какого-либо влияния на включение [метил-3Н]тимидина в Т-лим-фоциты селезенки (данные не приведены). Поскольку известно, что АКТГ(11-24) и лей-кокортикотропин связываются с рецептором АКТГ, обнаруженным на тимоцитах и макрофагах мыши [10, 11], было изучено влияние этих пептидов на стимулирующее действие
25000п
20000-
•л В 15000 н
£ В 10000
й
5000-
И
1
Рис. 3. Влияние иммунокортина (10-6 М) на пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки крысы на различных стадиях активации. Приведены средние значения опыт/контроль ±SEM трех независимых экспериментов.
1 — включение [метил-3Н]тимидина в нестимулирован-ные клетки;
2 — включение [метил-3Н]тимидина в клетки, стимулированные Кон А (5 мкг/мл);
3 — уровень пролиферации клеток, стимулированных Кон А, в присутствии иммунокортина (пептид добавляли одновременно с митогеном);
4 — уровень пролиферации клеток, стимулированных Кон А, в присутствии иммунокортина (пептид добавляли через 1 ч после инкубации с митогеном);
5 — уровень пролиферации клеток, стимулированных Кон А, в присутствии иммунокортина (митоген добавляли через 1 ч после инкубации с пептидом)
1 2,2 I 2,0-
X § !>81
(П Q*
I gi,6
Ь
fi1-4 Я о
8 1,24
В"
1,0-
и
Ю"10 10"9 10"8 10"7 10"6 [иммунокортин], м
10"5
Рис. 4. Влияние иммунокортина на пролиферацию В-лимфоцитов селезенки крысы, стимулированных ЛПС Salmonella typhi. Приведены средние значения ±SEM трех независимых экспериментов
иммунокортина на лимфоциты селезенки крысы. Было показано, что инкубирование спленоцитов с АКТГ(11-24) и лейкокортико-тропином в течение часа до внесения иммунокортина и митогена в среду культивирования приводило к ингибированию способности иммунокортина стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки (рис. 2). Таким образом, было установлено, что иммуно-кортин увеличивает пролиферацию митоген-
стимулированных Т-лимфоцитов селезенки крысы in vitro и это действие осуществляется через рецептор АКТГ.
Кроме того, нами было изучено влияние иммунокортина на пролиферацию Т-клеток на различных стадиях активации. В первом случае, спленоциты культивировали с пептидом (10-6 M) в течение часа, затем добавляли Кон А; во втором случае, пептид (10-6 M) и митоген вносили в среду культивирования одновременно, и в третьем случае, клетки инкубировали с Кон А, и через час добавляли пептид (10-6 M) (рис. 3). Действие иммунокортина было различным во всех трех случаях. Предварительная инкубация спленоцитов с пептидом приводила к увеличению включения [метил-3Н]тимидина в клетки на 45%. Тем не менее, иммунокортин подавлял пролиферацию Кон А стимулированных Т-лимфоци-тов на 55%. Так же пептид не оказывал никакого влияния на клетки при одновременном добавлении с митогеном. В связи с этим действие иммунокортина зависит от функциональной активности Т-лимфоцитов.
Также нами было изучено влияние иммунокортина на пролиферацию В-лимфоцитов селезенки, стимулированных ЛПС. Показано, что как и в случае с пролиферацией спленоцитов, активированных Кон А, иммунокортин увеличивает включение [метил-3Н]тимидина в диапазоне концентраций 10-8—10-6 M (рис. 4). Действие пептида было дозозависимым, максимальный эффект наблюдался при концентрации 10-6 M. Пролиферация B-лимфоцитов уменьшалась при концентрации пептида 5 х 10-5 и 10-5 M. Действие иммунокортина в концентрациях выше, чем 10-5 M не изучалось, так как они не являются физиологическими.
ОБСУЖДЕНИЕ
Во время стресса как эмоционального, так и физического, регулирование функции лимфоцитов возможно через два различных ней-роэндокринных пути. Первый путь — высвобождение иммуносупрессора — кортизола через систему гипоталамус — гипофиз — надпочечники, и второй путь — прямое взаимодействие с АКТГ гипофиза. Известно, что АКТГ влияет на пролиферацию Кон А-инду-цированных Т-лимфоцитов [2, 13] и действие гормона за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.