РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 1, с. 3-10
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ДЕЙСТВИЕ АКТГ-ПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА МИГРАЦИЮ, АДГЕЗИЮ И РАСПЛАСТЫВАНИЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ IN VITRO
© 2011 г. Ю.А. Ковалицкая*, А.Н. Фунтикова**, В.Б. Садовников*, Е.В. Наволоцкая*
*Филиал учреждения РАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Московская обл., г. Пущино, Россия;
**Нижегородский Государственный университет им. Н.И. Лобачевского,
Нижний Новгород, Россия
Поступила: 17.09.2010. Принята: 25.01.2011
Были синтезированы пептиды: фрагмент АКТГ (адренокортикотропный гормон) 15—18 (Lys-Lys-Arg-Arg) и его аналоги CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2, cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg), cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg). Изучено влияние синтезированных пептидов на адгезию, распластывание и миграцию перитонеальных макрофагов мыши. Установлено, что исследуемые пептиды оказывали модулирующее действие на макрофаги мыши: при низких концентрациях стимулировали адгезию и распластывание, в диапазоне физиологических концентраций — ингибировали эти функции макрофагов. Пептид cyclo (Lys-Lys-Arg-Arg) во всем диапазоне концентраций увеличивал спонтанную миграцию макрофагов до 80%, в то время как пептид cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg) подавлял подвижность клеток. Пептиды Lys-Lys-Arg-Arg и CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 стимулировали спонтанную миграцию макрофагов в концентрации 10-11 — 10-10М и 1мкМ соответственно. Учитывая то, что АКТГ блокировал влияние пептидов на адгезию макрофагов, можно предполагать, что действие исследуемых пептидов на макрофаги осуществляется через рецептор АКТГ.
Ключевые слова: адренокортикотропин (АКТГ), пептиды, макрофаги
ВВЕДЕНИЕ
Макрофаги — это клетки, которые осуществляют захват и переваривание микроорганизмов. Они первыми встают на борьбу с бактериями, вирусами и простейшими, проникшими в организм. Регуляция функциональной активности этих клеток зависит от целого ряда факторов. Установлено, что адренокортикотропный гормон (АКТГ) — гормон, играющий основную роль в ответе организма на стрессовое воздействие, оказывает влияние на клетки иммунной системы: макрофаги, Т- и В-лимфоциты [1 — 4]. Результаты исследований свидетельствуют о супрессирующем действии АКТГ на фагоцитоз и продукцию цитокинов макрофагами [1, 5]. Кроме того,
Адрес: 142290 Московская обл., г. Пущино, пр-т Науки, д. 6. E-mail: kovalitskaya@inbox.ru
с помощью современных методов показано, что в клетках иммунной системы (моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты и гранулоциты) имеется полный механизм для синтеза и секреции активных ПОМК (проопиомеланокор-тин)-производных пептидов — АКТГ и р-эн-дорфина [6, 7]. На макрофагах и лимфоцитах обнаружены меланокортиновые рецепторы 3 типа (МС3-И), с которыми взаимодействует гормон, регулируя функции надпочечников [5, 8].
Ранее показано, что минимальным фрагментом, необходимым для связывания АКТГ с рецептором, является фрагмент гормона 15—18 [9—10]. Использование биохимических методов ацетилирования, амидирования и циклизации при синтезе пептидов позволяет влиять на функции исходной молекулы. Поскольку фрагмент АКТГ (15—18) взаимодействует с рецептором АКТГ и действует как
его антагонист [9], целью данной работы было изучить влияние АКТГ(15—18) и его аналогов CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 , cyclo(Lys-Lys-Arg - Ar g ), cyc lo ( Lys - Lys - Arg - Arg - Lys- Lys-Arg -Arg) на адгезию, распластывание и миграцию перитонеальных макрофагов мыши in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пептиды
Химический синтез пептидов Lys-Lys-Arg-Arg и Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg осуществляли методом твердофазного синтеза пептидов с последовательным наращиванием пептидной цепи. Защищенный пептид получали по методике in situ на соответствующих амино-ацил полимерах c емкостью 0,7ммоль/г, используя синтезатор Applied Biosystems 430А, США [11]. Пептиды очищали с помощью препаративной ОФ ВЭЖХ. Полученные пептиды охарактеризовывали данными аналитической ОФ ВЭЖХ, аминокислотного анализа (аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США).
N-концевое ацетилирование Lys пептида CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 проводили как описано в статье [12]. Амидирование С-кон-цевой аминокислоты пептида CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 осуществляли с использованием остатка амидной смолы Rink (Boc-form, 0,45 мМ Boc/г, Applied Biosystems, Foster city, США). Циклизацию пептидов проводили обработкой раствором уксусной кислоты в ди-метилформамиде в присутствии диизопро-пилэтиламина. Защищенный циклический пептид высаживали эфиром, фильтровали, высушивали до постоянной массы и обрабатывали безводным жидким фтористым водородом.
Получение макрофагов
В работе были использованы лабораторные мыши линии Balb/c, полученные из питомника ФИБХ. Мыши были адаптированы к условиям нестерильного вивария, иммунная система мышей находилась в активном состоянии, поэтому дополнительные стимуляторы в работе не использовались. Перитоне-альные макрофаги мыши получали согласно рекомендациям Учитель и Фрейдлин [13 — 14]. Жизнеспособность полученных клеток
оценивали по тесту с трипановым синим и использовали в экспериментах. Жизнеспособность макрофагов превышала 95%.
Определение способности макрофагов к адгезии
Для оценки способности макрофагов прилипать к пластику (адгезии) клетки культивировали в 96-луночном планшете в среде RPMI-1460 (ПанЭко, Россия), содержащей 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 100 мкг/мл гента-мицина (ПанЭко, Россия), 5% эмбриональную сыворотку теленка (Sigma, США), в течение 1 часа в атмосфере 5% CO2 при 37 °С. Монослой макрофагов фиксировали метанолом в течение 5 мин и окрашивали красителем Гим-за. Подсчитывали число клеток, прилипших к 1 мм2 поверхности.
Определение способности макрофагов к распластыванию
Для изучения распластывания макрофаги инкубировали в 96-луночном планшете, как описано выше, в течение 1 часа, затем среду меняли и инкубировали 24 часа в атмосфере 5% CO2 при 37 °С. После этого, монослой макрофагов фиксировали метанолом в течение 5 мин и окрашивали красителем Гимза. Количество распластанных макрофагов подсчитывали под микроскопом с помощью окулярной сетки, распластанными считали макрофаги, у которых продольные размеры превышали поперечные в 3 раза. В каждой лунке просчитывали по 300 клеток.
Исследование миграции макрофагов
Для изучения миграции макрофагов использовали микрометод определения спонтанной подвижности клеток системы мо-нонуклеарных фагоцитов, разработанный Фалбуш [15]. Предварительно готовили 0,4%-ный раствор агарозы (Sigma, США), доводили его до кипения и помещали в термостат при температуре 60 °С. Суспензию клеток в среде RPMI-1460 (ПанЭко, Россия), содержащей 10%-ную эмбриональную сыворотку теленка (Sigma, США) (концентрация 107 клеток/мл), смешивали с равным объемом приготовленного раствора агарозы. Суспензию подогревали до 37 °С, в каждую лунку вносили по 1 мкл клеточной суспензии в агарозе. После застывания агарозы в каждую лунку вносили по 200 мкл среды RPMI-1460 (ПанЭко, Россия),
содержащей 5%-ную эмбриональную сыворотку теленка, 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 100 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия) и изучаемый пептид в диапазоне концентраций 10-15 — 10-5 М. Планшет инкубировали 12 часов в атмосфере 5% CO2 при 37 °С. Реакцию учитывали следующим образом: под микроскопом подсчитывали количество клеток, вышедших из капли агарозы. Для каждой концентрации ставили 4 — 5 повторностей.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel MS 2003. В статье приведены данные трех независимых экспериментов. Графическое изображение результатов проводили с помощью программы Origin 7.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рисунке 1 (а) видно, что циклические пептиды cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg) и cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg) в диапазоне концентрации 10-15—10-5 M ингибируют способность макрофагов прилипать к пластику. Действие cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg) было дозозависимым при концентрации 10-13—10-9 M, максимальный эффект наблюдался при концентрации пептида 1 нМ. Однако протестированный параллельно АКТГ(15—18) при концентрации 10-15—10-14 М оказывал стимулирующее действие на адгезию макрофагов (до 25%) (рис. 1, б). В остальном диапазоне концентраций Lys-Lys-Arg-Arg и CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2
1,2 1Д 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
1,4 1,3 1,2 1Д 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
1-пептид cyclo (KKRR);
2-пептид cyclo (KKRRKKRR)
10-15 10-13
ю-11 ю-9 ю-7 1о-5
Концентрация пептида, М
1-пептид cyclo KKRR;
2-пептид CH3CO-KKRR-NH2
1,3 -|
1,2-
в о 1,1 -
£ 1,0-
1 0,9 -
§ 0,8 -
о 0,7 -
U 0,6 -
1 0,5 -
U 0,4 -
я 0,3 -
1 0,2-
0,1 -
0,0 4
1,6 -|
й о 1,4 -
ь й 1,2-
-
§ 1,0-
о ■
ц 0,8 -
1 0,6 -
0,4-
g
о а 0,2-
Рч
0,0 -
10-15 1Q-13
■ I ' 1 ' 1 ' I
10-11 10-9 10-7 10-5 Концентрация пептида, М
б
1-пептид cyclo KKRR;
2-пептид CH3CO-KKRR-NH2
10"15 10"13 10"11 10"9 10"7 10"5 Концентрация пептида, M
10"15 10"13 10"11 10"9 10"7 10"5 Концентрация пептида, M
Рис. 1. Влияние а) cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg) и cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg) и б) Lys-Lys-Arg-Arg и CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 на адгезию перитонеальных макрофагов мыши. Приведены средние значения ± SEM трех независимых экспериментов. Lys-Lys-Arg-Arg обозначено однобуквенным кодом KKRR.
Рис. 2. Влияние а) cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg) и cyclo(Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg) и б) Lys-Lys-Arg-Arg и CH3CO-Lys-Lys-Arg-Arg-NH2 на распластывание перитонеаль-ных макрофагов мыши. Приведены средние значения ± SEM трех независимых экспериментов. Lys-Lys-Arg-Arg обозначено однобуквенным кодом KKRR.
2,0 -,
1,8-
1,6 -
о 1,4 -
"È 1,2-
Е
о i,o-
I 0,8 -
| 0,6 -
0,4 -
0,2 -
1-пептид cyclo (KKRR);
2-пептид cyclo (KKRRKKRR)
10"15 10"13 10"11 10"9 10~7 10"5 Концентрация пептида, M
„ 3500
I
§ 3000 й
g 2500
и
| 2000
S 1500 §
8 1000 500 0
i
о «
POS Q и з OOL, 5
1,8 1,6 н
1,4 1,2 H 1,0 0,8 -0,6 -0,4 0,2
1-пептид cyclo KKRR;
2-пептид CH3CO-KKRR-NH2
. 3500 ё
| 3000 g 2500 | 2000
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.