ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 4, с. 341-347
= БИОХИМИЯ
УДК 577.121.7-612.12
ДЕЙСТВИЕ р-АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА Ар25-35 НА ГЛИКОЛИТИЧЕСКИЕ И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ В ЭРИТРОЦИТАХ РАЗНОГО ВОЗРАСТА
© 2014 г. Л. А. Тихонова*, **, Ю. Г. Каминский*, Е. А. Косенко*, **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Институтская ул., 3 **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290Пущино, просп. Науки, 3
E-mail: eakos@rambler.ru Поступила в редакцию 10.08.2012 г.
Показано, что Р-амилоидный пептид Ар25_35 вызывал лизис эритроцитов разного возраста. Отмечено, что токсичность Ар25_35 положительно коррелировала с возрастом эритроцитов и концентрацией пептида, а активность гликолитических, антиокислительных ферментов и №+/К+-АТФазы снижалась по мере старения эритроцитов in vivo. В экспериментах in vitro обнаружено, что Ар25_35 снижал активность гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы и повышал активность №+/К+-АТФазы в старых эритроцитах в большей степени, чем в молодых клетках.
DOI: 10.7868/S0002332914040134
Р-амилоидные пептиды (АР) — это низкомолекулярные белки, являющиеся структурными компонентами амилоидных отложений или се-нильных бляшек, которые вызывают медленную дегенерацию нервных клеток в мозге при болезни Альцгеймера и при некоторых других нейродеге-неративных расстройствах (Shoji et al., 1992; Robakis, 1994). Ap —растворимые метаболиты (Haass et al., 1992; Shoji et al., 1992). Они содержатся в плазме крови как у пациентов с болезнью Альцгеймера, так и у здоровых лиц (Lewczuk et al., 2004), а также связываются со стенками кровеносных сосудов (De la Torre, 2002; Ravi et al., 2005) и взаимодействуют с эритроцитами in vivo.
При инкубации с Ар эритроциты лизируются (Mattson et al., 1997; Косенко и др., 2008), однако молекулярные механизмы этого явления не ясны. Есть данные, что нейротоксичность Ар связана с нарушением энергетического обмена (Casley et al., 2002) и окислительным стрессом в нейронах (Behl et al., 1994; Harris et al., 1995). Сходным может быть и механизм токсического действия Ар на эритроциты. Действительно, ингибирование гликолиза, Na+/К+-АТФазы и глутатионпероксидазы (ГП) усиливает токсическое действие Ар на эритроциты (Косенко и др., 2008). Наличие Ар в крови пациентов с болезнью Альцгеймера (Roher et al., 2009) может быть одним из факторов, вызывающих метаболический и окислительный стресс в эритроцитах.
Длительность жизни эритроцитов у крысы составляет от 37 (Lurie, Danon, 1992) до 66 сут (Dere-lanko, 1987), так что в кровотоке постоянно при-
сутствуют клетки разного возраста. Гибель эритроцитов происходит в результате нарушения энергетического обмена и повышения чувствительности клеток к повреждению при метаболическом стрессе (Seaman et al, 1980). У млекопитающих длительность жизни эритроцитов положительно коррелирует с активностью внутриклеточных антиокислительных ферментов супероксиддис-мутазы (СОД) и ГП, а также с содержанием глута-тиона (Kurata et al., 1993), что свидетельствует о регуляции длительности жизни клеток образованием кислородных радикалов и эффективностью внутренней антиокислительной системы. Поскольку активность глутатионтрансферазы (ГТ) в эритроцитах постепенно снижается с возрастом клеток, полагают, что старение эритроцитов связано также с ослаблением ферментной защиты от окислительного повреждения (Glass, Gershon, 1984), и в частности со снижением детоксициру-ющей способности ГТ (Fazi et al., 1991).
Действие Aß на эритроциты разного возраста не было изучено. Мы предположили, что старые эритроциты более чувствительны к токсическому действию Aß, чем молодые клетки.
Цель работы — проверить эту гипотезу и выяснить влияние Aß in vitro на гликолитические, антиокислительные ферменты и Na+/К+-АТФазу в эритроцитах разного возраста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эритроциты крысы разделяли на три возрастные фракции (молодые, средневозрастные (далее —
средние) и старые клетки) центрифугированием в градиенте плотности перколла (Seaman et al., 1980). К 0.25 мл крови добавляли 25 мкл 130 мМ цитрата натрия, рН 7.4. Затем кровь смешивали с фосфатным буферным раствором (10 мМ KH2PO4, рН 7.4), содержащим 150 мМ NaCl, 0.05 мМ этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и 0.02 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), в соотношении 2 : 1. Полученную суспензию пропускали через колонку, заполненную а-целлюло-зой и гемикристаллинцеллюлозой типа 50 в соотношении 1 : 1 и уравновешенную 0.9%-ным NaCl. Фильтрат собирали в центрифужную пробирку, установленную в лед, с 1/5 объема раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ KH2PO4, 10 мМ ЭДТА, рН 7.4, и центрифугировали 10 мин при 1000 g и 4°С. Затем эритроциты промывали 3 раза по 10 мин при 1000, 1300 и 1600 g. Осадок, содержащий эритроциты, ресуспендировали в растворе перколла (114 мМ NaCl, 0.5% глюкозы, 10 мМ KH2PO4, рН 7.4, 0.5 мМ ЭДТА, 0.2 мМ ФМСФ и 0.76 мл/мл перколла) до 15%-ного гематокрита (Lutz et al., 1992). Суспензию эритроцитов центрифугировали в течение 20 мин при 33 000 g и 4°С и собирали три фракции: верхний слой толщиной 1 мм — молодые эритроциты, средний слой (основной объем клеток, толщина слоя ~80 мм) с эритроцитами среднего возраста и нижний слой толщиной 1.5 мм — старые клетки. Каждую фракцию трижды промывали фосфатно-солевым буфером (10 мМ KH2PO4, рН 7.4, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0.5 мМ ЭДТА и 2.8 мМ глюкоза) при 1000, 1300, 1600 g и 4°С (по 10 мин) и суспендировали в этом растворе в соотношении 1 : 5.
Содержание гемоглобина (Hb) в эритроцитах определяли с помощью прибора Beckman Coulter ACT8 (США).
Аß25-35 и Аß35-25 растворяли в воде до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37°С для образования молекулярных агрегатов, как описано ранее (Соломадин и др., 2008). Об агрегации Аß судили по флуоресценции тио-флавина Т, добавляемого в оптическую кювету, при 482 нм (возбуждение при 360 нм). Лизис эритроцитов оценивали фотометрически. Клетки инкубировали в 0.9%-ном NaCl при 25°С в отсутствие или в присутствии Аß25-35, затем суспензию центрифугировали 10 мин при 1000 g и в суперна-танте измеряли абсорбцию при 540 нм как показатель лизиса эритроцитов. Степень лизиса определяли как число лизированных эритроцитов, отнесенное к общему числу клеток и выраженное в процентах. За 100% принимали абсорбцию супер-натанта после инкубации эритроцитов с 1 мМ до-децилсульфатом натрия. Контрольные клетки инкубировали с нетоксичным Аß35-25.
Активность ферментов определяли в гемоли-затах как необработанных эритроцитов, так и по-
сле инкубации клеток с Ар. Нелизированные (после инкубации с Ар25_35 или Ар35—25) эритроциты осаждали при 1000 g в течение 10 мин. Для получения гемолизатов эритроциты инкубировали в гипоосмотическом буфере (17 мМ триэтанол-амин, рН 7.4), содержащем 0.05 мМ этиленгли-кольтетраацетат, 1 мМ меркаптоэтанол и 0.02% сапонина, как описано ранее (Каш^ку г1 а1., 2010). Активность цитоплазматических ферментов гексокиназы (ГК) (КФ 2.7.1.1), пируваткина-зы (ПК) (КФ 2.7.1.40), глицеральдегидфосфатде-гидрогеназы (ГАФДГ) (КФ 1.2.1.12), лактатдегид-рогеназы (ЛДГ) (КФ 1.1.1.27) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) (КФ 1.1.1.49) определяли методами, описанными Бютлером (БеиНег, 1986), активность ФФК (КФ 2.7.1.11) -спектрофотометрически при 340 нм методом Босхарда и Стейнмана (Во88ИаМ, 81етшапп, 2008) и выражали в мкмоль/мин на 1 г НЬ.
Активность Ма+/К+-АТФазы (КФ 3.6.3.9) определяли модифицированным методом (Ко-8епко а1., 1994). К 1 мл среды инкубации (30 мМ гистидин, рН 7.4, 130 мМ ШС1, 20 мМ КС1, 4 мМ М§С12, 3 мМ АТФ, 1 мМ фосфоенолпируват, 10 мкмоль/мин на 1 мл ПК, 10 мкмоль/мин на 1 мл ЛДГ и 0.18 мМ НАДН), содержащей или не содержащей 1 мМ уабаин, добавляли 50 мкл гемо-лизата. Смесь инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл смеси 10%-ной трихлоруксусной кислоты с 2%-ной аскорбиновой кислотой. Затем смесь центрифугировали 5 мин при 3000 §, отбирали 1 мл супер-натанта, к нему добавляли 0.5 мл 1%-ного молиб-дата аммония и 1 мл смеси 2%-ного арсенита натрия с 2%-ным цитратом натрия и 2%-ной уксусной кислотой. Через 15 мин измеряли поглощение при 700 нм. Активность фермента вычисляли по разнице скоростей образования неорганического фосфата в отсутствие и в присутствии уа-баина и выражали в мкмоль/мин на 1 г НЬ.
Все измерения выполняли при 37°С и 340 нм с использованием двухлучевого регистрирующего спектрофотометра Ц^коп 923 (Корея).
Активность антиокислительных ферментов СОД (КФ 1.15.1.1), каталазы (КФ 1.11.1.6) и ГП (КФ 1.11.1.9) в гемолизате определяли описанным ранее способом (Ко8епко а1, 1997), активность ГТ (КФ 2.5.1.18) — методом Козера и др. (Ко2ег г1 а1., 2003), а содержание белка — с биуре-товым реактивом.
Результаты выражали в виде среднего значения и стандартной ошибки. Так как значения всех анализируемых переменных определяются бесконечным числом независимых факторов (например, составом мембран эритроцитов, внутриклеточными метаболическими процессами), мы предположили, что распределение этих значений соответствует нормальному закону. Нормаль-
ность распределения переменных с числом n, превышающим 5, подтвердили с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Различия между группами анализировали методом ANOVA с использованием i-критерия Стьюдента для множественных сравнений и поправкой Бонферрони с помощью компьютерной программы Prizm 5.0 для Windows (GraphPad Software, США).
Экспериментальные процедуры выполнены в соответствии с Европейскими правилами по использованию лабораторных животных 1986 г. (Правила лабораторной практики в РФ, 2003).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Степень лизиса эритроцитов, не разделенных на возрастные фракции, зависит от концентрации Ар25-35 (Соломадин и др., 2008). Мы проверили, имеется ли такая связь между молодыми и старыми эритроцитами. Было установлено, что зависимость лизиса эритроцитов двух возрастов от концентрации Ар25-35 линейна в диапазоне концентраций амилоида от 0 до 25 мкМ (рис. 1). Уже в 1 мкМ концентрации Ар25-35 вызывает лизис молодых и старых к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.