БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 7, с. 864 - 872
УДК 577.153.3
ДЕЙСТВИЕ ДЕТЕРГЕНТОВ, ТРИПСИНА И ИОНОВ ДВУХВАЛЕНТНЫХ МЕТАЛЛОВ НА МЕЖФАЗНУЮ АКТИВАЦИЮ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ Д
© 2014 Ш.Р. Мадьяров
Институт генофонда растений и животных АНРУз, Узбекистан, 100125 Ташкент, ул. Боги-шамол, 32; электронная почта: shuhm@yandex.ru
Поступила в редакцию 14.01.14 После доработки 25.03.14
Изучено влияние детергентов, трипсина и ионов двухвалентных металлов на продукцию фосфатидной и ли-зофосфатидной кислот при действии фосфолипазы Д (РЬБ) на лецитин и лизолецитин. Показано, что эти продукты реакции и додецилсульфат-ионы являются активаторами РЬБ, другие анионные детергенты были менее эффективны. Обнаружено, что функционирующий фермент менее подвержен инактивации трипсином. Ионы двухвалентных металлов по активирующему действию на РЬБ при гидролизе лецитина и ли-золецитина могут быть расположены в следующей последовательности: Са2+ > 8г2+ > Ва2+ > М^2+. Полученные результаты рассматриваются в свете предложенного механизма активации и функционирования РЬБ с участием кластеров фосфатидатов и лизофосфатидатов. Такое Ме2+-индуцированное формирование рафтов или микродоменов из продуктов гидролиза фосфолипидов может объяснить не только активацию и саморегуляцию РЬБ, но и воздействие этого явления на другие компоненты и свойства биомембран. РЬБ и другие липолитические ферменты можно отнести к латеральным векторным ферментам.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фосфолипаза Д, детергенты, трипсин, ионы металлов, фосфатидаты, лизофосфати-даты, активация, функционирование, регуляция, биомембраны.
В последнее десятилетие показано, что широко распространенная у живых организмов фосфолипаза Д (РЬБ, КФ-1.3.3.4) обладает не только гидролитическими, алкилирующими, гомеостатическими, но и регуляторными свойствами, участвует во внутриклеточном транспорте белков, митозе, сигналинге и многих других функциях живой клетки [1—5]. Фосфатид-ная (РА) и лизофосфатидная кислоты (ЬРА), продуцируемые под действием РЬБ при гидролизе фосфолипидов (РЬ) и их лизоформ (ЬРЬ), являются вторичными мессенджерами, изменяющими физические свойства липидного бислоя мембран и вызывающими слияние или почкование пузырьков во время межклеточного переноса секретируемых веществ. Кроме того, РА принимает участие в ресинтезе РЬ и образова-
Принятые сокращения: PLA2, PLC, PLD — фосфолипазы А2, С и Д соответственно; PL — фосфолипиды; LPL — лизофосфолипиды; РС — фосфатидилхолин; LPC — лизо-фосфатидилхолин; РА — фосфатидная кислота; LPA — лизофосфатидная кислота; DOCA — дезоксихолевая кислота; TCA — таурохолевая кислота; SDS — додецилсульфат натрия; DG — диацилглицерин; FFA — свободная жирная кислота; Ме2+ — ионы двухвалентных металлов.
нии еще двух вторичных мессенджеров: диацил-глицерина и фосфатидилинозитол-4,5-дифос-фата [6]. Физиологическая роль и механизм действия РЬБ интенсивно исследуются [6—9].
Субстраты РЬБ — РЬ и ЬРЬ — образуют в водных системах различные структурные образования (мономолекулярные и бислои, мицеллы, липосомы, ламеллярные и др. микрогетерогенные структуры) и обуславливают первоначально неспецифическую адсорбцию водорастворимой РЬБ на поверхности суперсубстрата [7, 10]. Последующая медленная стадия активации РЬБ характеризуется индукционным периодом, присущим ферментам из растений, животных и микроорганизмов и являющимся специфической особенностью РЬБ [7, 10]. В случае гидролиза дисперсий очищенного природного и синтетического фосфатидилхолина (РС) лаг-периоды настолько велики, что для выявления активности РЬБ используют различные неспецифические активаторы — органические растворители, детергенты, адсорбенты и УЗ-воздействие [7, 9, 10]. В отличие от РС, мицел-лярные дисперсии лизофосфатидилхолина (ЬРС) гидролизовались без активаторов с раз-
личными по длительности лаг-периодами (т) [10, 11].
В данной работе изучено действие природных и синтетического детергентов — лизофос-фатидата кальция (продукта гидролиза ЬРЬ), та-урохолата, дезоксихолата и додецилсульфата натрия — в присутствии ионов Са2+, 8г2+, Ва2+ и на гидролиз лецитина и лизолецитина РЬБ из различных источников, а также влияние трипсина на Са2+-активируемую реакцию. Показано, что образующиеся в результате ферментативного процесса РА или ЬРА в присутствии ионов двухвалентных металлов формируют на субстратной поверхности специализированные кластеры (рафты, микродомены), которые способны активировать и регулировать катализ РЬБ. Желчные кислоты и также образуют в присутствии изученных ионов подобные кластеры, обеспечивающие активацию и регуляцию РЬБ в ЬРЬ- и, особенно, в РС-субстратных системах. Важные выводы из полученных результатов — это векторность процесса гидролиза РЬ или ЬРЬ этим ферментом, а также стабилизация РЬБ от факторов среды [7, 10], в том числе от протеолиза трипсином. Предложенная гипотеза кластерообразования продуктов реакции, активации и регуляции РЬБ в присутствии двухвалентных металлов подтверждается результатами в аналогичных исследованиях с другими липо-литическими ферментами и может быть использована для объяснения различных физиологических и патологических эффектов, связанных с мембранным липолизом.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали PLD из редьки дайкон Rafanus sativus longipinatus, очищенную экстракцией, центрифугированием, двумя стадиями ацетонового осаждения и стадией гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе CL—4B [11]; препараты PLD из листьев капусты Brassica sativa и стрептомицета Streptomices ohromofuscus; трипсин тип IIS из панкреазы быка; L-a-фосфатидилхо-лин, L-a-лизофосфатидилхолин из куриного яичного желтка; дезоксихолевую (DOCA), таурохоле-вую (TCA) кислоты, додецилсульфат натрия (SDS), ЭДТА, Tris (TRISMA), пластинки для ТСХ фирмы «Sigma-Aldridge Chem. Co» (США); соли двухвалентных металлов CaCl2 ■ 2H2O, SrCl2 ■ 6H2O, BaCl2 ■ 2H2O, MgCl2 ■ 7H2O, CH3-COONa ■ 5H2O, CH3-COOH и другие реактивы квалификации х.ч. и о.с.ч.; свежеперегнанные органические растворители и бидистиллированную воду.
LPA — продукт гидролиза LPC PLD из редьки дайкон — отделяли центрифугированием,
осадок 3 раза промывали 0,2 М NaCl и центрифугировали, а затем ресуспендировали в рабочем буферном растворе. Водные дисперсии PC и LPC готовили из концентрированных растворов испарением органического растворителя, сус-пендированием в бидистиллированной воде для использования на следующий день. Для получения липосомных везикул полученную таким образом дисперсию PC обрабатывали ультразвуком при 22 кГц в течение 10 мин при охлаждении льдом (0—4°) с помощью дезинтегратора УЗДН-1 (Россия).
Измерение активностей PLD по РС и LPC. Стандартная реакционная смесь объемом 2,5 мл содержала 12,5 мкМ PC-липосомных везикул, 0—75 мкМ Ме2+, 0,1 М натрий-ацетатный буфер (рН 5,6) или 0,05 М Tris-ацетатный буфер (рН 7,2) и 0,1 мл раствора PLD. Реакцию проводили при постоянном перемешивании при 45° в течение 30 мин. Определение выделенного в реакции хо-лина проводили по ранее описанной методике [10]. За единицу активности принято количество фермента, образующего 1 мкмоль холина за 1 мин. При определении активности PLD с ми-целлярной дисперсией LPC реакцию проводили как в отсутствие детергентов, так и при их различных концентрациях и в присутствии солей (указаны в подписях к рисункам). После добавления фермента в реакционную среду проводили регистрацию оптической плотности ^480, в том числе и непрерывную, как описано ранее [11]. За единицу активности в этом случае принимали количество фермента, изменяющее ^480 на 1 единицу за 1 мин. Параллельно определению активностей в отобранных пробах проводили ТСХ-хроматографию продуктов гидролиза в системе хлороформ—метанол—вода (65 : 25 : 4 по объему) и хлороформ-метанол—28%-ный аммиак (65 : 35 : 5 по объему). Ранее было показано молярное соответствие выделенного в реакции холина и LPA [10]. Измерения проводили на спектрофотометрах SmartSpec 3000 («Bio-Rad», США) и Uvikon-942 («Kontron Instruments», Франция).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее изученное действие детергентов на активность РЬБ при гидролизе РС [7, 9] подтвердилось при использовании в качестве субстрата мицеллярного ЬРС [10] (рис. 1, а).
Активаторами реакции выступали отрицательно заряженные поверхностно-активные ионы ЬРА (удельная активность 0,560 ед./мг), а также таурохолат (ТСА) (0,30 ед./мг), дезокси-холат (БОСА) (0,270 ед./мг) и додецилсульфат (0,604 ед./мг).
0 50 100 150 200 250 300
Время, мин
Рис. 1. Действие анионных детергентов на активацию и регуляцию PLD. а - При гидролизе LPC очищенной PLD из редьки дайкон R. sativus longipinnatus: 1 - без детергента, 2 - в присутствии DOCA, 3 - TCA, 4 - LPA, 5 - SDS, по 0,2 мМ, [LPC] = 2 мМ и [Са2+] = 20 мМ. б - Влияние SDS на кинетику гидролиза лизолецитина PLD из Str. chromofuscus: 1 - без SDS; 2 - 0,2, 3 - 0,5, 4 - 0,7 мМ, 5 - 1,0 мМ SDS; PLD - 2,25 мкг, [Са2+] = 20 мМ, рН 5,6, 30°. Р - LPA, продукт реакции
Добавление к реакционной среде в нулевой момент времени 0,2 мМ продукта реакции (Са2+—ЬРА) полностью снимало лаг-период [11]. Положительно заряженные и неионные детергенты [10], как и катионные цитотоксины УС-1 и УС-5 из яда среднеазиатской кобры [12], ингибировали процесс гидролиза лизолецитина при неизменных лаг-периодах, тогда как кислый мембраноактивный полипептид из яда каракурта несколько уменьшал лаг-период без влияния на каталитическую активность РЬБ. Таким образом, один из продуктов реакции (ЬРА) является природным активатором РЬБ. Активация же в присутствии желчных солей и по-видимому, аналогична активации под действием ЬРА, а желчные соли и действуют как аналоги природного активатора. На рис. 1, б представлена кинетика гидролиза лизолецитина при различных концентрациях под действием РЬБ из ^ скгото/ызст с массой ~50 кДа. В этом случае кинетические кривые гидролиза ЬРС имеют сложный 8-образный характер.
На рис. 2, а представлена кинетика гидролиза лизолецитина и влияние на нее трипсина, добавленного в различные моменты реакции, откуда видно торможение реакции гидролиза лизолецитина при сохранении активности РЬБ, имеющейся в момент добавления
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.