БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 578.825.11.:577.252.55:577.113.6.088
ДЕЙСТВИЕ ДИМЕРНОГО АНАЛОГА НЕТРОПСИНА 15Lys-bis-Nt И АЦИКЛОВИРА НА РЕПРОДУКЦИЮ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА. ПОИСК ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГЕРПЕСА С ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К 15Lys-bis-Nt И АЦИКЛОВИРУ
© 2015 г. В. Л. Андронова, С. Л. Гроховский, А. Н. Суровая, член-корреспондент РАН Г. В. Гурский, Г. А. Галегов
Поступило 30.10.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215050242
Одной из проблем, возникающих при проведении химиотерапии вирусных инфекций, является формирование мутантных вариантов вируса, резистентных к действию лекарственных препаратов (ЛП). Вероятность развития лекарственной устойчивости непосредственно зависит от эффективности подавления репродукции вируса в процессе проведения курса химиотерапии. При частичном ингибировании репликации вируса в очаге инфекции создаются условия для селекции резистентных вариантов вируса, существующих в вирусной популяции [1—3]. Использование двойных и тройных комбинаций ЛП с разным механизмом антивирусного действия позволяет существенно повысить их противовирусную активность, обеспечивая тем самым достижение максимального терапевтического эффекта даже при использовании ЛП в концентрациях, меньших, чем концентрации, необходимые при проведении монотерапии. Это снижает риск формирования резистентных популяций вируса или даже предотвращает их возникновение, что было показано как в опытах in vitro, так и в клинических условиях на моделях ВИЧ-1, вируса гепатита C [4, 5], а также на модели вируса простого герпеса типов 1 и 2 (ВПГ-1 и 2) [1, 6, 7].
Резистентность к ацикловиру (АЦВ), базовому ЛП для лечения герпетических инфекций, формируется достаточно быстро как в лабораторных условиях при проведении серийного пассирования вируса в присутствии АЦВ, так и в условиях
Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского
Министерства здравоохранения РФ, Москва E-mail: andronova.vl@yandex.ru Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук, Москва
клиники, например, при проведении супрессивной терапии генитального герпеса. Особенно остро проблема лекарственной резистентности встаёт при проведении длительной терапии герпетической инфекции у больных с ослабленным иммунитетом: частота изоляции АЦВ-резистент-ных штаммов вируса составляет 2.8—36% [8, 9].
Ранее нами было установлено, что при использовании АЦВ в комбинации с димерным аналогами нетропсина наблюдается синергический эффект при подавлении репродукции ВПГ-1 в культуре клеток Vero E6 [7]. В основе наблюдаемого эффекта лежит различие в механизмах действия АЦВ и димерных аналогов нетропсина на репликацию вирусной ДНК: АЦВ ингибирует стадию элонгации при синтезе ДНК вирусной ДНК-по-лимеразой, в то время как бис-нетропсины подавляют процесс инициации репликации вирусной ДНК [10—12]. Однако влияние сочетанного использования этих соединений на скорость формирования популяции ВПГ-1, резистентной к одному из лекарственных агентов или к их комбинации, изучено еще недостаточно. Это и послужило основанием для проведения исследований, результаты которых представлены в настоящей работе.
Ранее мы обнаружили, что димерные производные антибиотика нетропсина избирательно связываются с A+T-кластером в начале репликации вируса простого герпеса (OriS и OriL) и эффективно подавляют репродукцию вируса в культуре клеток Vero E6 [10, 11]. При связывании с A+T-кластером в OriS бис-нетропсины увеличивают температуру плавления A+T-кластера и уменьшают вероятность вызванного тепловыми флуктуациями "раскрытия" AT-пар оснований [10—12], что необходимо для инициации раскручивания ДНК хеликазой UL9 вируса герпеса. В отличие от АЦВ, бис-не-тропсины ингибируют процесс инициации ре-
595
7*
Н2Я©Г
N^
H2C' Н
H
-N
0* D-^
H2C®
N-
H2C
H
H
4
0"CN>
;
(' N-a
xí
H
o
©
NH3
©NH
© NH, Q H
II
o
NH
NHfN® NHj"
Pt-bis-Nt
3 H ,C I /PN
o
N
H O-N.
ty
s
C^ N CO
W?
.CH,
CH3
H
I ^
N-C^ ~N ' II NHf i Ф
O NH
NH3 o ,NH3 |
/
H
V H
c-n
O
Pt*-bis-Nt
H 1
N ~c-n.
N II
o
-os
C
w
O
CH3
H ^-N®
.N-J I'
H^
H3N © )-NH3
HNv
r>-/ h
O=v
уЧ h
o n
Nt
I o
NH3
NH3
H I
c-n
П0гП>
"o ^
H
■c-N
и
o
H
1,
H O
15Lys-bis-Nt
-C—N"
TV
N
H I
C-N-11 O
l^O
H-N'
©ch
CH3
NH,
© NH3 © 3
Рис. 1. Химическая структура антибиотика нетропсина (Nt) и его димерных аналогов Pt-bis-Nt, Pt*-bis-Nt и 15Lys-bis-Nt.
H
H
O
O
пликации вирусной ДНК, т.е. действуют на ранних стадиях жизненного цикла вируса еще до начала синтеза вирусной ДНК.
На рис. 1 представлены химические формулы бис-нетропсинов, противовирусная активность
которых в культуре клеток Vero E6, а также их ци-тотоксичность были изучены нами ранее [1, 7, 11]. Показано, что Pt-bis-Nt и 15Lys-bis-Nt эффективно ингибируют репродукцию как чувствительных, так и резистентных к АЦВ вариантов
ДЕЙСТВИЕ ДИМЕРТОГО AHAHO^
597
Век III Веж I A+l
5 1 -MMGMGTGÄGMCGCGMGCGTTCGCÄCTTCGTCCC ИТ АТЙТИ ÄTÜTTÄTT ÄGGGCGM- 3 1 (SI) 3 1 -ТТТТСТТ CÄCTCTTGCGCTTCGCMGC GTGMGC ÄGGGTTÄTÄTÄTÄTÄTMTMTCCCGCTT - 5 1 ( S 2 )
557 100
50
S1(Tm = 43°C)
ООО
o®
oO°°ü xXxXX
Pt*-bis-Nt + S1 (Tm = 53°C)
Xх о Xх
О X
о wx .
о хл
QDDQQa^a8-ïïÏB15LyS
15Lys-bis-Nt + S1 (Tm = 67°C)
20
40
60
80 t, °C
Рис. 2. Кривые плавления комплексов димерных аналогов нетропсина Pt*-bis-Nt и 15Lys-bis-Nt c 63-членным олиго-нуклеотидом S1, присутствующим в начале репликации OriS вируса простого герпеса. Указаны температуры плавления (Tm) AT-богатой шпильки в свободном олигонуклеотиде S1 и комплексах олигонуклеотида с бис-нетропсинами. Кривые плавления были получены методом FRET (Forster resonance energy transfer). Краситель карбоксиродамин 6Ж и тушитель Black Hole 2 были присоединены ковалентно к 5'- и З'-концам олигонуклеотида S1. По оси ординат — интенсивность флуоресценции флуорофора при 557 нм. Условия: 0.01 M какодилатный буфер, pH 7 в присутствии 0.1 M NaCl.
0
ВПГ-1, в то время как Pt*-bis-Nt оказался малоактивным соединением. На рис. 2 представлены кривые плавления свободного 63-членного олигонуклеотида S1, присутствующего в начале репликации OriS вируса герпеса и его комплексов c 15Lys-bis-Nt в соотношении 1:1 и Pt*-bis-Nt. В растворе олигонуклеотид S1 спонтанно сворачивается в две шпильки: GC-богатую шпильку, c которой избирательно связывается хеликаза UL9 вируса герпеса, и AT-богатую шпильку, c которой связываются бис-нетропсины. Из рис. 2 видно, что формы кривых плавления комплексов 15Lys-bis-Nt и Pt*-bis-Nt c AT-богатой шпилькой в олигонуклеотиде S1 значительно различаются. 15Lys-bis-Nt увеличивает температуру плавления AT-богатой шпильки на 24°C, в то время как Pt*-bis-Nt увеличивает температуру шпильки только на 10°С.
Цель настоящей работы — изучение противовирусной активности димерного производного нетропсина 15Lys-bis-Nt при его применении в комбинации с АЦВ и исследование формирования лекарственной устойчивости. 15Lys-bis-Nt был синтезирован в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (патент РФ на изобретение RUS 2265610 20.04. 2004), а его ДНК-связывающая и противовирусная активности исследованы в работах [7, 11, 12]. В настоящее
время 15Lys-bis-Nt проходит стадию доклинических испытаний.
В эксперименте использовали культуру клеток почек зеленой мартышки Vero E6. Вирус герпеса простого типа 1 штамм L2 (ВПГ-1/L^ был получен из Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ.
Условия пассирования вируса. Использовали множественность инфицирования (м. и.), равную 1 БОЕ/клетку, что позволило увеличить количество АЦВ-резистентных вирусных частиц, существующих в исходной вирусной популяции в качестве минорных компонентов.
Чувствительность вируса к тестируемым соединениям изучали в соответствии с принятым в международной практике методом ингибирова-ния развития вирусиндуцированного цитопати-ческого эффекта (ЦПЭ), как подробно описано нами ранее [10, 11], и выражали в виде величины IC50 — концентрации соединения, при которой наблюдается 50%-е ингибирование развития вирусного ЦПЭ при сравнении с контролем (м. и. — 0.1 БОЕ/клетку, продолжительность инкубации — 48 ч).
Комбинированный эффект соединений оценивали путем построения изоболограммы [14].
В соответствии с международными рекомендациями по дозированию для лечения и профи-
Концентрация ацикловира, мкг/мл
Концентрация 15Lys-bis-Nt, мкг/мл
Рис. 3. Противовирусный эффект комбинации 15Lys-bis-Nt и АЦВ на модели вируса герпеса простого типа 1 в культуре клеток "Vfero E6. Указаны весовые отношения 15Lys-bis-Nt и ацикловира, которые подобраны таким образом, что суммарный противовирусный эффект от действия обоих компонентов в культуре клеток "Vfero E6 соответствует 4 х IC50.
лактики рецидивов генитального герпеса используют АЦВ per os в дозе 400 мг, 3—5 раз/день, что соответствует концентрации АЦВ в плазме крови, равной 0.94—1.97 мкг/мл [15]. Поэтому с целью получения резистентной популяции при проведении серийного пассирования вируса в культуре клеток концентрация АЦВ в среде поддержки составляла 1.50 мкг/мл, что соответствует приблизительно 4 х IC50.
При изучении влияния 15Lys-bis-Nt на скорость формирования резистентности ВПГ к АЦВ условия пассирования были сопоставимы с таковыми в присутствии одного АЦВ. C этой целью концентрации 15Lys-bis-Nt и АЦВ в комбинации подбирали таким образом, чтобы их суммарный эффект также был равен 4 х IC50. Для установления концентраций 15Lys-bis-Nt и АЦВ, которые при сочетанном использовании этих соединений обеспечивают 50%-е ингибирование развития вирусного ЦПЭ по сравнению с контролем (что соответствует 1С50), мы изучили комбинированный эффект 15Lys-bis-Nt и АЦВ, который оценивали путем построения изоболограммы, как показано на рис. 3. Эти эксперименты подтвердили ранее установленный ярко выраженный синергический характер взаимодействия этих соединений при сочетанном использовании [7, 10]. Так, например, в условиях комбинированного воздействия 15Lys-bis-Nt и АЦВ можно ингибировать на 50% развитие вирусиндуцированного ЦПЭ в к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.