научная статья по теме ДЕЙСТВИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА И ХОЛЕСТЕРИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ ПЕПТИДОВ НА ФАГОЦИТОЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ IC-21 Биология

Текст научной статьи на тему «ДЕЙСТВИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА И ХОЛЕСТЕРИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ ПЕПТИДОВ НА ФАГОЦИТОЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ IC-21»

и у некоторых других белков, взаимодействующих с холестерином, в том числе у кавеолина - классического маркерного белка рафтов. Мы провели поиск аминокислотных последовательностей, аналогичных холестерин-связывающему консенсусу PBR, у нескольких интегральных белков, имеющих отношение к фагоцитозу и способных кластеризоваться в рафтах [17]. Оказалось, что в трансмембранной области некоторых белков обнаруживается консервативная последовательность из 7-10 аминокислотных остатков, сходная с холесте-рин-связывающим консенсусом (VLNYYVW). Ключевыми гидрофобными аминокислотами в этой последовательности являлись валин, лейцин, тирозин и триптофан (V-L-Y-W). Например, фа-гоцитозный рецептор FcyRI имел последовательность LVNTVLW; ATP-зависимые каналы - пури-норецепторы P2Xx и P2X2 имели последовательности VLVYVIGW и LILLYFVW соответственно, коннексин Сх43 - LLIQWYIY. Естественно предположить, что эти аминокислотные последовательности участвуют во взаимодействиях интегральных белков с холестерином рафтов. Такие взаимодействия моли бы объяснить холестерин-зависимость как фагоцитоза, так и других процессов, протекающих с образованием рафтов. С целью проверки этого предположения в данной работе мы изучали действие двух новых синтетических пептидов холестерин-связывающего консенсуса, VLNYYVW и LLVYPW, на фагоцитозную активность культивируемых макрофагов линии IC-21. В клеточных системах функциональные эффекты таких пептидов еще не исследовались.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки. В качестве клеточной системы использовали клетки линии IC-21 из коллекции клеточных культур Института вирусологии РАМН. Клетки линии IC-21 получены из перитонеальных макрофагов мыши путем трансформации вирусом SV-40 [18]. Проведенные нами ранее эксперименты показали, что клетки линии IC-21 представляют удобную модель для электрофизиологических исследований эндо- и фагоцитоза [19]. Клетки IC-21 культивировали в среде DMEM ("GIBCO", США) в присутствии гентамицина (40 ед/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Hy Clone", США), в СО2-атмосфере при 37°С. Пересев осуществляли с помощью раствора Версена дважды в неделю.

Пептиды. Пептиды Ac-VLNYYVW и LLVYPW (у обоих С-конец - амид) были синтезированы в компании "Unifect" (Москва, ИБХ), чистота препаратов контролировалась с помощью хроматогра-фического (ВЭЖХ) и масс-спектрометрического (MALDI) методов. Оба пептида очень гидрофоб-ны, и для введения их в водный раствор в качестве растворителя использовали DMSO. Концентриро-

ванный раствор содержал 1-20 мкг/мкл пептида. При добавлении к клеткам этого раствора конечная концентрация DMSO составляла 0.5-1.3%, а пептида - от 5 до 100 мкг/мл (при концентрации в водной среде выше ~100 мкг/мл пептиды выпадали в осадок).

Определение фагоцитозной активности (флуоресцентная микроскопия). Активность фагоцитоза оценивали по количеству поглощенных клетками карбоксилированных латексных флуоресцентных микросфер диаметром 2 мкм ("Molecular Probes", США). Эксперименты проводили по следующей схеме. К прикрепленным распластанным клеткам во флаконах (25 см2) или чашках Петри (10 см2) добавляли суспензию неопсонизированных частиц из расчета 5 х 105-5 х 106 частиц/см2 (исходная концентрация суспензии ~109 частиц/мл) и инкубировали при 37°С в течение заданного промежутка времени (от 30 до 90 мин) в культуральной среде в присутствии добавок (DMSO с пептидом или без него) или в их отсутствие (контроль). Затем не связанные c клетками частицы удаляли. Для этого клетки либо просто тщательно промывали бескальциевым физиологическим раствором и далее средой DMEM и оставляли в чашках для флуоресцентной микроскопии, либо пересевали на новые чашки Петри; в последнем случае клетки суспендировали раствором Версена с трипсином. Подсчет числа ассоциированных с клетками частиц проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 200M (Германия). Для этого на каждой чашке производили съемку 4-6 полей зрения (10-20 клеток на поле) в режиме фазового контраста и в режиме флуоресценции микросфер (длина волны возбуждающего света - 490 нм, эмиссии - 550 нм). По микрофотографиям подсчитывали число частиц в клетках. Оценки эффектов DMSO и пептидов проводились в 4-5 независимых экспериментах для каждой обработки. Статистический анализ (вычисление средних значений и стандартной ошибки, оценка достоверности различий) проводили с помощью встроенных функций графической программы OriginPro 7.5 ("OriginLab Corporation", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культивируемые макрофаги IC-21 хорошо поглощают неопсонизированные латексные частицы (рис. 1) [19] и представляют простую и удобную модельную систему для изучения фагоцитоза. В контрольных экспериментах, при добавлении к клеткам суспензии частиц в концентрации ~106 частиц/см2, уже через 30 мин инкубации около 20% клеток содержало частицы, в среднем около двух на клетку. Через 60-90 мин инкубации доля клеток с частицами составляла 50-70%, а среднее число частиц на клетку - до 3-5 (рис. 1-3); в некоторых клетках число частиц достигало 10 и более. Если фагоцитоз проходил в присутствии 0.5-1.3%

о

О

Рис. 1. Фагоцитозная активность культивируемых макрофагов 1С-21. а - Фазовый контраст, б - флуоресценция. Клетки инкубировали в присутствии 2-мкм частиц в течение 60 мин. Масштабная полоска - 20 мкм.

DMSO, то число частиц на клетку было на 20-30% ниже, чем в параллельном контрольном препарате без добавок (таблица, колонки (1) и (2)). В эксперименте, который иллюстрирует рис. 2, контрольные клетки содержали в среднем по 3.1 ± 0.3 (п = = 46), а у клеток, фагоцитировавших в присутствии 1% DMSO, среднее число частиц на клетку достоверно (р = 0.05) снижалось до 2.3 ± 0.2 (п = 55). Если фагоцитоз протекал в присутствии DMSO в сочетании с пептидом VLNYYVW - фрагментом холе-стерин-связывающего консенсуса (5-100 мкг/мл), то угнетающий эффект DMSO на активность фагоцитоза усиливался (таблица, колонки (3) и (4)). В примере, приведенном на рис. 2, среднее число поглощенных частиц на клетку в присутствии 100 мкг/мл пептида VLNYYVW и 1% DMSO составляло 1.6 ± 0.2 (п = 66) и было на 30% ниже, чем в присутствии 1% DMSO без пептида.

В отличие от VLNYYVW, другой пептид -LLVYPW (20-100 мкг/мл; конечная концентрация DMSO 0.5-1.3%) - ослаблял эффект DMSO на фа-гоцитозную активность (таблица, колонки (5) и (6)). В эксперименте, приведенном на рис. 3, DMSO (1%) уменьшал число поглощенных частиц на ~20% по сравнению с контролем (4.5 ± 0.4 (п = 95) и 5.7 ± 0.7 (п = 71) соответственно). При инкубации клеток в присутствии 1% DMSO и 40 мкг/мл пептида LLVYPW среднее число клеток на частицу восстанавливалось до контрольного значения (5.8 ± ± 0.5, п = 89).

Таким образом, мы обнаружили, что активность фагоцитоза неопсонизированных частиц макрофагами 1С-21 модулируется синтетическими пептидами-аналогами холестерин-связывающего консенсуса. Эти эффекты на клетках описаны впервые. Одним из возможных механизмов действия исследованных пептидов на активность фа-

Эффекты БМБО и пептидов VLNYYVW и LLVYPW на активность фагоцитоза у культивируемых макрофагов 1С-21

№ эксперимента (1) Контроль (2) БМБО (3) БМБО (4) VLNYYVW (5) БМБО (6) LLVYPW

1 3.3 ± 0.4 (68) 2.1 ± 0.1* (89) - - 2.1 ± 0.1 (89) 2.6 ± 0.4** (44)

2 5.7 ± 0.7 (71) 4.5 ± 0.4* (95) - - 4.5 ± 0.4 (95) 5.8 ± 0.5* (89)

3 21 ± 3 (19) 12 ± 1* (23) - - 12 ± 1 (23) 19 ± 4** (13)

4 3.1 ± 0.3 (45) 2.3 ± 0.2* (55) 2.3 ± 0.2 (55) 1.6 ± 0.2* (66) - -

5 - - 3.6 ± 0.3 (44) 2.7 ± 0.2* (133) - -

6 - - 2.4 ± 0.2 (152) 2.1 ± 0.1** (185) - -

7 - - 3.1 ± 0.3 (100) 2.7 ± 0.2* (153) - -

8 - - - - 2.7 ± 0.2 (180) 3.3 ± 0.3** (117)

9 - - - - 2.4 ± 0.2 (152) 2.5 ± 0.2 (232)

10 1.4 ± 0.2 (112) 1.0 ± 0.2* (98) - - - -

Примечание. Показаны средние значения числа поглощенных частиц на клетку ± стандартная ошибка (в скобках - число измерений, и); звездочками отмечена достоверность различий между средними значениями групп БМ8О (2) та. контроль (1), VLNYYVW (4) vs. БМ8О (3) и LLVYPW (6) vs. БМ8О (5) для данного эксперимента (* р = 0.05, ** р = 0.1). Концентрация суспензии частиц в экспериментах 2 и 3 составляла 106 и 5 х 106 см-2 соответственно, в остальных - 5 х 105 см-2.

Число частиц на клетку

Число частиц на клетку

Рис. 2. Действие DMSO и пептида VLNYYVW на фаго-цитозную активность макрофагов IC-21. 1 - Контроль (без добавок), 2 - DMSO (1%), 3 - DMSO (1%) + пептид VLNYYVW (100 мкг/мл). По оси ординат - среднее число частиц на клетку. Концентрация частиц 5 х 105 см-2, длительность инкубации 80 мин. * - различия между средними значениями (2 vs. 1, 3 vs. 2) статистически значимы при p = 0.05 (ANOVA one-way).

Рис. 3. Действие DMSO и пептида LLVYPW на фагоци-тозную активность макрофагов IC-21. 1 - Контроль (без добавок), 2 - DMSO (1%), 3 - DMSO (1%) + пептид LLVYPW (40 мкг/мл). По оси ординат - среднее число частиц на клетку. Концентрация частиц 106 см-2; длительность инкубации 75 мин. * - различия между средними значениями статистически значимы при p = 0.1 (ANOVA one-way).

гоцитоза может быть конкуренция с "рафтовыми" белками за связывание с холестерином. Другая возможность - это влияние пептидов на формирование самих рафтов в мембране подобно тому, как это наблюдается в искусственных системах. Так, Эпанд и др. [20] показали, что фрагмент холестерин-связы-вающего консенсуса пептид LWYIK стимулирует образование богатых холестерином доменов в бис-лойных мембранах из фосфатидилхолина и холестерина. Механизм взаимодействий подобных пептидов и интегрального белка с холестерином пока неясен. Для оценки возможности и эффективности таких взаимодействий требуется разработка трехмерных моделей трансмембранных белков; однако база данных PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) на данный момент располагает полноценной трехмерной структурой только для М1Р26. На взаимодействия с циклопентанпергидрофенантреновым ядром холестерина могут претендовать ароматические

аминокислоты, способные к стэкинг-взаимодей-ствию, например триптофан, фенилаланин, тирозин. Эти аминокислоты присутствуют в трансмембранных последовательностях, подобных холесте-рин-связывающему консенсусу [17].

В

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком