БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 3, с. 458-465
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 574.632: 582.263
ДЕЙСТВИЕ ФЕНОЛОВ НА ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И РЕАКЦИИ Р700 ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ
Scenedesmus quadricauda
© 2014 г. Д.Н. Маторин, С.Е. Плеханов, Л.Б. Братковская, О.В. Яковлева, А.А. Алексеев
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119892, Москва, Ленинские горы Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова, Якутск E-mail: та1от[п@ЫорЬу&.msu. ru Поступила в p едакцию
Изучено действие фенолов, содержащихся в стоках целлюлозо-бумажной промышленности, на фотосинтез микроводоросли Scenedesmus quadrwauda. Проведен анализ индукционных кривых быстрой и замедленной флуоресценции и световых кривых нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла микроводоросли. Обнаружено ингибирование энергизации фотосинтетических мембран при низких концентрациях (0,1 мМ) фенола и пирокатехина. В более высоких концентрациях эти вещества ингибируют электронный транспорт в ФC II и увеличивают долю Q В-нево останавливающих центров. В р езультате этого наблюдается замедление скорости восстановления пигмента реакционного центра Ф C I - P700. Полученные результаты позволяют предложить использование параметров индукционных кривых быстрой и замедленной флуоресценции для обнаружения появления фенола и пирокатехина в среде на ранних стадиях токсического воздействия.
Ключевые слова: Scenedesmus quadrwauda, фенолы, флуоресценция хлорофилла, фотосинтез, биотестирование.
Фенольные соединения находят в со ставе сточных вод многих предпр иятий целлюлозно-бумажной промышленности, они являются опасными для водных экосистем [1—3]. На изолированных хлоропластах проведено изучение механизмов действия сложных производных фенола - гербицидов [4-6]. Показана возможность связывания хинонных аналогов сложных фе-нольных соединений белками фотосистемы II (ФC II) [5,6].
Ранее было изучено действие дифенолов (пирокатехина, гидрохинона, резорцина) на рост, параметры быстрой флуоресценции (Fv/Fm) и интенсивность замедленной водоросли Chlorella pyrenoidosa. Показано, что эти фенолы в низких концентрациях (0,1 мМ) существенно подавляют р ост численности и энергизацию фотосинтетических мембран клеток этих микроводорослей. Влияние дифенолов на электрон-транспортные реакции в Ф C II по параметру Fv/Fm наблюдалось при более высоких концентрациях (от 1 мМ и выше).
Сокращения: Ф C - фотосистема, ЗФ - замедленная флуоресценция.
Известно, что на начальных этапах токсического воздействия или при низкой концентрации токсиканта величина Fv/Fm может снижаться незначительно, что ограничивает чувствительность метода. В этом случае может быть полезным анализ кинетики световой индукции, характеризующей электронный транспорт внутри Ф C II и между Ф C II и Ф C I [8-10]. Кинетики световой индукции переменной флуоресценции (OJIP), измеренные in vivo в миллисекундном диапазоне при освещении насыщающим светом, характеризуются тремя восходящими фазами: OJ, JI, и IP и последующей фазой снижения флуоресценции, отражающими в основном кинетику перехода центров Ф C II из открытого состояния с окисленным Qa в закрытое состояние с восстановленными акцепторами [11,12].
Измерение индукционных кривых флуоресценции с высоким разрешением занимает всего несколько секунд и проводится на приборах типа PAM и PEA. На приборе М-РЕА2 появилась возможность наряду с регистрацией флуоресценции измерять изменения поглощения P700 (пигмента реакционного центра Ф C I). Та-
ким образом, прибор позволяет одновр еменно следить за отдельными реакциями Ф С I и Ф С II [8,13]. Более того, прибор регистр ирует индукционные изменения замедленной флуоресценции, которые дают информацию о кинетике электро химического градиента протонов на фотосинтетической мембране [12].
В настоящей работе с использованием разных флуор иметров проведены исследования процессов в Ф С I и Ф С II и электрохимического градиента протонов на тилакоидной мембране водоросли Scenedesmus quadricauda после воздействия фенола и пирокатехина в концентрациях, вызывающих незначительные изменения величины ^у^. Целью работы было изучение возможности применения анализа разных параметров флуоресценции хлорофилла для оценки состояния фотосинтетического аппар ата водорослей при токсическом воздействии фенолов в низких концентрациях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта использовали культуру зеленых протококковых водорослей сценедес-мус - Scenedesmus quadricauda (Тигр.) БгеЪ. Культивирование проводили накопительным методом на искусственной питательной среде Успенского при освещении 30 мкЕ/м2 и температур е 18-20°С.
Измерения показателей флуоресценции водорослей проводили на импульсном флуори-метре WateгPAM Effelгich, Гер мания). В
адаптированных к темноте образцах регистрировали постоянную и максимальную флуоресценцию (^ш), а также максимальный выход переменной флуор есценции (^/^ = Ет -который является мерой потенциальной квантовой эффективности Ф С II. Измерения световых зависимостей различных параметр ов флуоресценции на свету выполнялись пр и последовательном увеличении интенсивности от 0 до 800 мкЕ/м2 с [14]. Время освещения со ставляло 50 с. В конце каждого сеанса освещения при определенной интенсивности с использованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 мкЕ/м2 с) регистрировались параметры а также выход флуоресценции на свету Е({). На основании всех пар аметров рассчитывали нефотохимическое тушение флуор есценции NPQ = (^ -квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС II как отношение У = — и относитель-
ную скорость нециклического электронного транспорта пр и данной интенсивности света ЕТЯ. Скорость транспорта электронов рассчи-
тывали по формуле ETR = Y■Ei-0,5, где Ei -освещенность, мкЕ/м2-с. На основании полученных световых кривых ETR оценивали следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона кривой, а), максимальную относительную скорость электронов по электрон-транспортной цепи (ETRmax) и насыщающую интенсивность света (Ен). Величину а рассчитывали как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам, лежащим на светоли-митированном участке Р/Е кривой, ETRmax -как среднее по значениям ETR, находящимся на светонасыщающем участке. Ен рассчитывали по формуле Ен = ETRmax/a. Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой [14].
На импульсном флуориметре М -РЕА2 (Han-saTeA, Англия) проводили одновременно регистрацию индукции быстрой и замедленной флуоресценции, а также изменений Р700 по поглощению при длине 820 нм с высоким временным разрешением (начиная с 0,01 мс) [8,13].
Регистрация быстрой и замедленной флуоресценции производится при чередовании ак-тиничного света (627 нм, 1200 мкЕ/м2с ) и темновых интервалов. Перед измерением образцы водорослей концентрировали на мембранном фильтре, затем отфильтрованный образец помещали в измерительную ячейку и выдерживали в темноте в течение 10 мин. Важно отметить, что измерения на флуориметре М-РЕА2 выполняются только на клетках, предварительно отфильтрованных на поверхность мембранного фильтра. Ранее проведенные контрольные измерения на флуориметре Aqua-Реп в кюветах показали, что применение процедуры обогащения проб на фильтре не влияло на физиологическое состояние клеток [8].
Индукционную кр ивую замедленной флуоресценции (ЗФ) в миллисекундном интервале затухания (2-3 мс) измеряли также отдельно на фосфороскопической установке, описанной ранее [15].
Для флуоресцентных измерений использовали культуру водоросли на экспоненциальной фазе роста (2 сут). Исследуемые вещества добавляли к суспензии клеток, инкубировали в течение 24 ч и проводили измерения. Концентрация клеток перед добавлением препаратов составляла 250 тыс. кл. мл-1.
Для опытов использовали препараты фе-нольных соединений фирмы «Sigma» (США). Все измерения проводили в пяти повторениях.
Таблица 1. Параметры световых зависимостей флуоресценции клеток S. цыайпсаыйа в контроле и после добавления фенола и пирокатехина (суточная инкубация)
Параметры Контроль Фенол Пирокатехин
флуоресценции 10-4 М 10-3 М 10-5 М 10-4 М 10-3 М
F /F V m 0,723 ± 0,01 0,716 ± 0,01 0,703 ± 0,02 0,718 ± 0,01 0,703 ± 0,02 0,7 ± 0,01
NPQ при 200 мкЕм-2с-1 1,455 ± 0,01 0,908 ± 0,01 0,885 ± 0,02 0,986 ± 0,02 0,933 ± 0,02 0,899 ± 0,01
NPQ при 800 мкЕм-2с-1 1,757 ± 0,01 1,252 ± 0,01 1,166 ± 0,02 1,358 ± 0,02 1,284 ± 0,02 1,163 ± 0,01
гЕТЯ max а Ен, мкЕм-2с-1 33 ± 2,1 (100%) 0,195 169 ± 36 31,7 ± 2,8 (96%) 0,192 165 ± 48 29,7 ± 2,4 (90%) 0,187 159 ± 42 32,5 ± 2,7 (98%) 0,195 167 ± 39 29,9 ± 2,6 (91%) 0,186 161 ± 51 28,7 ± 2,1 (87%) 0,173 166 ± 56
Примечание: Fv/Fm - параметры проб в темноте; NPQ - нефотохимическое тушение;. Параметры, описывающие зависимость электронного транспорта (гЕТЯ) от освещенности (световые кривые): максимальная относительная скорость нециклического транспорта электронов (гЕТЯтах), коэффициент максимальной утилизации световой энергии, угол наклона световой кривой (а) и насыщающая интенсивность света (Ен)
На рисунках приведены результаты характерных опытов, повторяющиеся не менее тр ех р аз.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что величина Fv/Fm является потенциальным квантовым выходом фотохимии Ф С II, котор ая связана с р азложением воды и выделением кислорода [14]. Представленные в табл. 1 результаты свидетельствуют о том, что фенол в концентрациях до 10-3 М и пирокатехина в концентр ациях до 10-4 М в течение 24 ч мало влияли на инактивацию ФС II по пара-метру Fv/Fm, что согласуется с полученными нами ранее [7] данными о слабом токсическом действии этих веществ на электронный транспорт.
Наиболее контрастные различия у водорослей при действии фенола и пирокатехина были выявлены через сутки при измер ении пар амет-ров флуор есценции на свету пр и разной интенсивности, т.е. в условиях увеличивающейся световой нагр узки. Методика измерения световых кривых в настоящее время все шире используется в эколого-физиологических исследован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.