ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 258-267
УДК 579.61
ДЕЙСТВИЕ ГЕМОЛИЗИНА II Bacillus cereus НА КЛЕТКИ ГЕПАТОЦИТОВ
© 2015 г. О. А. Холодков, Ж. И. Бударина, Ж. И. Андреева-Ковалевская,
А. В. Сиунов, А. С. Солонин
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: solonin@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Исследована эффективность повышения проницаемости (пермеабилизации) мембран первичных клеток печени гемолизином II Bacillus cereus. Оценку степени пермеабилизации проводили по измерению интенсивности флуоресценции различных низкомолекулярных красителей, входящих через поры внутрь обрабатываемых гемолизином клеток. Отмечена высокая эффективность действия гемолизина HlyII на клеточные стенки гепатоцитов, превышающая эффективность действия неионного детергента дигитонина, обычно используемого для образования пор в различных клеточных мембранах. Продемонстрирована обратимость пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов. Полученные в работе данные могут быть применены при определении пороформирующей активности, механизмов действия гепатопротекторов, а также и для оценки токсичности действия на печень различных низкомолекулярных лекарственных препаратов.
Ключевые слова: пороформирующие токсины, пермеабилизация мембран, первичные клетки печени мыши, гликокаликс, обратимая пермеабилизация, эритроциты.
DOI: 10.7868/S0555109915020099
Гемолизин II (HlyII) Bacillus cereus является сек-ретируемым белком, принадлежащим к семейству ß-складчатых порообразующих цитолизинов. Показано, что он действует на проницаемость мембран различных эукариотических клеток.
Токсины B. cereus часто вызывают тяжелые пищевые отравления, сопровождающиеся диареей [1], что является основной причиной активного изучения токсинов, вырабатываемых B. cereus и его ближайшим родственником B. thuringiensis.
В настоящее время для производства инсектицидных препаратов широко используется B. thu-ringiensis, что приводит к широкомасштабному внесению этого микроорганизма в окружающую среду. Другой важной проблемой является бактериологическое загрязнение производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. При этом B. cereus — один из основных бактериальных загрязнителей. Способность вызывать лизис эритроцитов или гемолиз является одним из свойств, характерных для всех известных штаммов этого микроорганизма. При этом в зависимости от штамма гемолитический фенотип B. cereus варьирует как по количественным, так и по качественным характеристикам [2]. Это связано с тем, что способность к гемолизу у этого микроорганизма обусловлена наличием не одного гемолитического белка, как считалось долгое время [3], а целого
ряда и спектр продуцируемых гемолизинов является штаммоспецифичным признаком В. сегеш. Ряд внеклеточных токсинов В. сегеш рассматриваются как потенциальные факторы патогенно -сти, которые способствуют развитию инфекции и могут вызывать диаррейный и эметический синдромы, а также заболевания глаз, нервной системы, маститы и другие заболевания. Присутствие этих токсинов обусловливает гемолитическую, цитотоксическую и некротическую активность фильтрата культур энтеротоксичных штаммов В. сегеш. Лизис эритроцитов или гемолиз, который является характерным признаком В. сегеш и широко используется исследователями в качестве фенотипического признака при анализе цитоли-тических токсинов [3]. Гемолитическая активность различных штаммов В. сегеш отличается как по количественными, так и качественными характеристиками [4, 5]. Ранее считалось, что гемолитическая активность определяется в основном цереолизином АВ и гемолизином BL [6]. Клонирование гена гемолизина II В. сегеш в лаборатории Кузьмина Н.П. (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН) позволило поставить точку в многолетней дискуссии о существовании этого токсина, как отдельного гемолитического фактора [7]. До завершения работы по клонированию гена гемолизина II его самостоятельное существование неоднократно ставилось под сомнение. Ранее предполагали, что гемолитическую активность
проявляют другие известные токсины B. cereus, считая гемолизин II фрагментом цереолизина [5] или фосфолипазы С [6], или объясняли гемолиз, вызванный этим токсином, активностью цереолизина АВ.
Аминокислотная последовательность гемолизина II не имела сходства с уже известными токсинами B. cereus. Он состоит из 412 аминокислотных остатков [8], его молекулярная масса до секреции из клетки составляет 45.6 кДа, а масса зрелой формы — 42.3 кДа. В процессе созревания и секреции N-концевой участок гемолизина II, содержащий 31 аминокислотный остаток отщепляется с участием сигнальной пептидазы [9]. Анализ аминокислотной последовательности гемолизина II показал сходство этого белка с представителями семейства Р-складчатых порооб-разующих цитолизинов [8]. Так, последовательность гемолизина II гомологична (31.2% идентичных остатков) последовательности альфа-токсина Staphylococcus aureus, хотя и содержит в С-конце-вой части дополнительно 94 аминокислотных остатка, отсутствующие во всех, на сегодняшней день изученных Р-складчатых порообразующих цитолизинов и не являющихся необходимыми для образования пор [10, 11]. Гемолизин II в отличие от цереолизина O не ингибируется холестерином, проявляет ярко выраженный эффект Арре-ниуса и имеет лаг-фазу (протяженную задержку) при лизисе эритроцитов [9, 12].
Каждый мономер гемолизина II встраивает свой обогащенный глицином сегмент в естественную или искусственную мембрану с образованием трансмембранных пор, внутренний диаметр которых составляет 1.5—2.0 нм [12, 13]. Анион-селективные трансмембранные каналы, формируемые гемолизином II, вызывают деполяризацию цито-плазматической мембраны и гибель клеток-мишеней. Показано, что поры, образованные гемолизином II, в основном состоят из семи одинаковых субъединиц, однако наблюдали также и образование минорных фракций пор, содержащих как 6 так и 8 субъединиц [10, 13]. Эффективность действия гемолизина II продемонстрирована на различных клетках и организмах [9, 12—15]. Несмотря на то, что не все штаммы B. cereus и B. thuring-iensis способны синтезировать гемолизин II [16— 18], этот токсин можно считать вторым по значению патогенным фактором после цереолизина O [18], так как он присутствует во всех исследованных штаммах B. сereus, обладающих патогенным потенциалом [19, 20]. В то же время во всех описанных к настоящему времени штаммах B. anthra-sis, ген гемолизина II имеет мутацию сдвига рамки и потому не функционирует [16].
HlyII является одним из немногих, описанных факторов вирулентности B. сereus, который не урегулируется PlcR, центральным регулятором
транскрипции генов вирулентности в B. cereus [21, 22]. Вместо этого, было показано, что ген гемолизина негативно регулируется собственным транскрипционным регулятором HlylIR [23, 24] и глобальным регулятором Fur [25, 26]. Гены hlylI и hlyIIR локализованы в том же хромосомном локу-се Bc 3523 и 3522 Вс соответственно, в штамме АТСС 14579, но не входят в один оперон. Ген hlyIIR расположен непосредственно за геном hlyII на расстоянии около 300 пар нуклеотидов. Анализ как аминокислотной последовательности белка HlyIIR [8], так и его пространственной структуры [28] позволяет отнести его к ДНК-свя-зывающим транскрипционным регуляторам семейства TetR/AcrA. Анализы in vitro показали, что рекомбинантный HlyIIR регулирует транскрипцию гена hlyII через специфическое связывание его двух димеров с совершенным 44-нуклеотид-ным инвертированным повтором, центр которого находится на расстоянии 48 п. н. выше стартовой точки транскрипции гена hlyII [27]. Эффективность транскрипции гена hlyII в присутствии HlyIIR уменьшается в десятки раз. Белок HlyIIR содержит большую гидрофобную полость, способную разместить лиганд с молекулярной массой до 500 Да [28]. Таким образом, можно предположить, что в регуляции экспрессии гена гемолизина может участвовать кофактор, который связываясь с молекулами негативного транскрипционного регулятора HlyIIR, изменяет его пространственную структуру. Предполагаемое изменение конформации регулятора уменьшает эффективность его специфического взаимодействия с оператором, что приводит к значительному увеличению экспрессии гена hlyII. Способность патогенных микроорганизмов реагировать на сигналы окружающей среды, например концентрацию железа, является ключом к выживанию бактерий и осуществлению успешного заражения. Использование методов in vivo и in vitro позволило продемонстрировать, что экспрессия гена hlyII также негативно регулируется с помощью железа, благодаря прямому взаимодействию глобального регулятора Fur с участком ДНК, перекрывающим его стартовую точку транскрипции [25]. При повышенном синтезе белка Fur экспрессия гена hlyII снижается из-за конкуренции этого белка с РНК-полимеразой за место посадки на ДНК [26]. Эффективность экспрессии гена hlyII зависит от согласованной его регуляции как белком HlyIIR, так и Fur. Влияние последнего максимально проявляется на ранних стадиях роста бактерий. Кроме того, наблюдается увеличение эффективности транскрипции гена гемолизина II в средах с пониженным содержанием ионов железа. Подобный эффект проявляется при попадании B. cereus в эукариотические макроорганизмы, где обычно наблюдается дефицит свободных ионов железа. По-видимому, в таких условиях это
связано с необходимостью увеличения экспрессии гена Му11 для лизиса части клеток и обеспечения бактерий необходимыми питательными веществами. Описанные наблюдения демонстрируют связь между вирулентностью бактерий и эффективностью метаболизма железа [29, 15].
При попадании в организм хозяина с пищей споры В. сегеш прорастают в кишечнике, часть из них попадает в кровяное русло и может достигать тканей мозга, сердечных клапанов, печени и других тканей организма. Возможное постоянное проникновение спор в кровь обеспечивается также через поверхности ран, глаза и при внутривенном введении лекарств [30, 31]. Повышенный риск инфицирования этой бактерией наблюдается у людей с ослабленным иммун
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.