БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 4, с. 278-287
УДК 581.1:577.352:547.3
ДЕЙСТВИЕ ГИДРОЛИЗУЕМОГО ТАНИНА НА НАТИВНЫЕ И ИСКУССТВЕННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
© 2014 г. М. П. Борисова1*, А. А. Катаев2, С. М. Мавлянов3, Н. Г. Абдулладжанова3
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Россия Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта: mdborisova@bk.ru 2Институт биофизики клетки РАН, 142290, Россия, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3 3Институт биоорганической химии АНРУз, 100125, Узбекистан, Ташкент, ул. Абдуллаева, 83
Поступила в редакцию 17.01.2014 г.
Изучено действие гидролизуемого танина на плазматическую мембрану гигантской клетки водоросли Chara corallina и на искусственную бислойную липидную мембрану (БЛМ). Обнаружено до-зозависимое блокирование хлорных каналов танином в мембране водоросли. Показано, что в присутствии гидролизуемого танина в БЛМ возникают скачки тока, которые свидетельствуют об образовании ионных каналов. Наличие холестерина в составе БЛМ увеличивает время жизни канала в открытом состоянии. Каналы имеют анионную селективность. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидролизуемые танины являются мембраноактивными веществами, которые образуют в клеточной мембране анионные каналы.
Ключевые слова: танин, ионные каналы, Chara corallina, БЛМ.
Б01: 10.7868/80233475514040021
ВВЕДЕНИЕ
Полифенолы уже длительное время являются объектом целенаправленного применения и изучения. В настоящее время описано свыше шести с половиной тысяч полифенолов, выделенных из растений, которые придают вкус и цвет фруктам, овощам, ягодам и цветам. Показано, что наиболее эффективные природные антиоксиданты относятся к полифенолам [1—7]. Некоторые из этих веществ стимулируют иммунную систему, подавляют рост бактерий, [8, 9], обладают антигипер-тензивной [10] и желчегонной [8] активностью. У полифенолов обнаружена противоопухолевая [10, 11, 13—17] и проапоптозная [13, 15, 16] активность, а также противовоспалительные и анти-диарейные свойства [18].
К многочисленной группе полифенолов относятся танины. Класс танинов разделяется на гидролизуемые и конденсированные (негидролизуе-мые) танины. Гидролизуемые танины представляют собой эфиры многоатомных спиртов (глюкоза) и галловой кислоты (и ее производных), которые при действии на них кислот и оснований образуют углеводы и фенолкарбоновые кислоты. К настоящему времени установлена способность танинов и катехинов влиять на физические свойства мембран, регулировать клеточный метаболизм [19—22], устанавливать связь
между соседними поверхностями бислоев, инициировать мембранную агрегацию [23—25]. Много работ посвящено изучению взаимодействия этих веществ с белками и липидами [14, 21, 25, 26]. Предполагается электростатическое взаимодействие полифенолов с гидрофильной частью фосфолипидов и возможность проникновения полифенолов в гидрофобную область клеточной мембраны с уменьшением межфазного пространства от 15 до 5 А [13, 19, 23].
Моделями для изучения служили клетки крови, диссоциированные мышцы лягушки или многослойные везикулы. Использовались методы ЯМР и электронной микрофотографии, флуоресцентный метод, техника пэтч-кламп. Согласно большинству исследований, для взаимодействия с поверхностными группами на мембранах важен заряд, который несут полифенолы. Полярные гидролизуемые танины и катехины хорошо связываются с заряженными группами белков и липидов [19—20, 22, 25]. Неполярные танины могут проникать в гидрофобную область мембран [23]. Значение полярности полифенолов для взаимодействия их с мембранами показано в опытах на мультислойных везикулах с использованием метода ЯМР [19]. Из всех исследованных полифенолов (катехин, эпигаллокатехин и проантоциа-нидин) только гидролизуемый танин проникал в
HO
Рис. 1. Структурная формула гидролизуемого танина — основного вещества препарата рутан.
гидрофобную область бислоя. Изменения физических свойств мембран при действии танинов могут влиять на темпы липидного и белкового окисления [22]. В работе [27] использовали таниновую и галловую кислоты для блокирования хлорных каналов скелетной мышцы лягушки. Для блокирования Са2+-зависимого хлорного тока использовали таниновую кислоту, ее аналоги и другие галлотанины (эпикатехин, катехин, малви-дин-3-глюкозид), содержащиеся в вине и зеленых чаях [28]. Хлорные токи, которые обеспечивались каналообразующим белком ТМЕМ16А, при концентрации танина выше 6 мкМ полностью подавлялись. Другие галлотанины плохо или совсем не блокировали Са2+-зависимый хлорный ток. Са2+-зависимые хлорные каналы (CaCCs), которые образованы белком CFTR Cl—, не блокировались ни при какой концентрации танина.
В данной работе мы использовали препарат рутан — высушенный экстракт из листьев растения сумак (Rhus typhina L.), а также выделенный из экстракта гидролизуемый танин (3,6-бис-О-дигалло-ил-1,2,4-три-О-галлоил-Р-^-глюкоза). Биологическая активность рутана, оцениваемая по индукции синтеза интерферона, была значительно выше, чем амиксина: при пероральном введении рутана и амиксина содержание интерферона составляло 512—1024 и 64—128 ед/мл соответственно. Противовирусная активность рутана была в 4—6 раз выше, чем активность зовиракса (Zovi-raks); обнаружена также антиоксидантная, желчегонная и гепатопротекторная активность рутана [8, 9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались гидролизуемый танин и препарат рутан высушенный экстракт из листьев сумака (Rhus typhina L.), полученный в Институте биоорганической химии УзАН. Экстракт представляет собой порошок светло-коричневого цвета, хорошо растворимый в воде. Основное вещество экстракта — гидролизуемый танин (3,6-бис-0-дигаллоил-1,2,4-три-0-галлоил-ß-^D-глюкоза), его содержание в экстракте — 74%. Структурная формула танина показана на рис. 1. В состав экстракта также входят: рутин (1%); 2,3-ди-0-галлоил^-.0-глюкоза (2%); 2-О-галлоил-ß-^D-глюкоза (2%); 3-О-галлоил^-.0-глюкоза (2%); 6-О-галлоил^-.0-глюкоза (2%); 1,4,6-три-О-галлоил-ß-^-глюкоза (5%); 1,2,3,4,6-пента-О-галлоил^-.0-глюкоза (10%); кверцетин (0.5%); кампферол (0.5%); галловая кислота (1%).
Клетки харовой водоросли Chara corallina выращивали при температуре 18—20°C в искусственной прудовой воде. Измерение токов (I = ICa + ICl) при изменении потенциала на мембране проводили в режиме фиксации напряжения на рабочем участке клетки длиной 2 мм с помощью классической четырехэлектродной методики [29—31]. Диаметр клеток варьировал от 0.6 до 0.9 мм. Для адекватного сравнения тока на разных клетках оценивали плотность тока в А/м2. Для регистрации мембранного потенциала использовались стеклянные микропипетки (диаметр кончика 5—10 мкм), заполненные агаром, содержащим 100 мМ KCl. Хлорированные серебряные проволочные электроды (Ag/AgCl) служили в качестве внешних то-
Концентрация танина, мкг/мл
Рис. 2. Действие танина на интегральные токи плазмалеммы клетки Chara corallina. 1 — контроль; 2-6 — добавки танина, мкг/мл: 2 — 4, 3 — 8, 4 — 16, 5 — 32, 6 — 64. Il — ток утечки. На вставке показана зависимость блокирования хлорного тока от концентрации танина. Приведена нормированная кривая, построенная по пиковым значениям хлорной компоненты интегрального тока (n = 7).
ковых электродов. Напряжение на мембране фиксировали на уровне потенциала покоя —180 мВ. Период восстановления тока для клеток составляет 1.5—2 мин, поэтому деполяризующие импульсы потенциала подавали последовательно через 2 мин [29]. Для фиксации напряжения на мембране использовали усилитель Dagan 8500 (США). Для одновременной регистрации медленных и быстрых процессов в качестве управляющих и регистрирующих устройств использовали два компьютера с платами ЦАП/АЦП Data Translation DT2801A и LCard 1250. Мониторинг экспериментов осуществляли с помощью пакетов программ Bio-Qest и Pclamp 6, полученные результаты обрабатывали с помощью программ WinWCP 4.4.7 (University of Strathclyde) и Origin8. Все измерения на клетке проводились в растворе, содержащем (в мМ): 0.1 КС1, 1.0 NaCl, 1.0 CaCl2, 1.0 HEPES-трис, pH 7.3.
Для формирования искусственных мембран использовали раствор в гептане растительного лецитина из сои (Z-a-фосфатидилхолин Type IV—S, 20 мг/мл; Sigma, США). В части экспериментов в липидный раствор добавляли 5% холестерина (Serva, Германия). Мембраны формировали по методу Мюллера—Рудина [32], окружающий раствор содержал NaCl или KCl в разных концентрациях и 5 мМ HEPES-трис (Sigma), pH 7.3. Регистрация тока велась с использованием платы ЦАП/АЦП DT2801A и специализированной программы "БЛМ", разработанной А.Я. Зильбер-штейном. Все измерения проводились при комнатной температуре (21—23°С). Исследуемый агент всегда вносился в отсек камеры, где находился измерительный электрод. Исключение указано в подписи к рисунку. На рисунках, иллю-
стрирующих эксперименты на БЛМ, показан знак потенциала в противоположном «внешнем» отсеке камеры.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Действие танина на трансмембранные токи клеток Chara corallina. На рис. 2 приведены интегральные токовые кривые, полученные до (кривая 1) и после (кривые 2-6) добавления танина в концентрации от 1 до 64 мкг/мл. Токи получены при деполяризации мембраны от —180 до —40 мВ в течение 6 с. Видно, что после внесения танина происходит постепенное уменьшение амплитуды тока до определенного (стационарного) уровня при данной концентрации танина. Стационарной мы считали амплитуду тока, если она не менялась в ответ на деполяризацию мембраны не менее 3 раз. После достижения стационарного уровня мы вносили следующую концентрацию танина. Интегральный ток состоит из быстрой кальциевой и медленной Са2+-зависимой хлорной компоненты. При достижении максимума хлорного тока кальциевый ток уже инактивиро-ван [29, 31]. Поэтому кальциевый ток не вносил своего вклада при определении пикового значения хлорного тока. На врезке рис. 2 показана зависимость блокирования хлорного тока от концентрации танина. Приведена нормированная кривая, построенная по пиковым значениям хлорной компоненты интегрального тока [29].
Поскольку хлорные каналы активируются ионами Са2+ [29], необходим
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.