РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 333-337
= КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ =
ДЕЙСТВИЕ ИК ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС IN VIVO
© 2009 г. Р.К. Чайлахян, Ю.В. Герасимов, А.П. Свиридов*, А.В. Кондюрин*, А.Х. Тамбиев**, В.Н. Баграташвили*
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия;
*Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, г. Троицк Московской области, Россия;
"Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Поступила: 17.08.2009. Принята: 28.08.2009
Исследовали влияние фрагментарного лазерного нагрева на изменение численности мультипотентных иезенхимальны стволовых клеток (ММСК) в костном мозге крыс в зависимости от дозы излучения (длина волны 1560 нм). Облучение костного мозга голени крыс производили через костную ткань с помощью оптического волокна диаметром 0,6 мм контактно в десяти точках отстоящих на расстоянии 1 мм друг от друга. Длина волны лазерного излучения 1560 нм, длительность 0,5 с, мощность варьировали в пределах от 0,1 до 1,2 Вт. Одинаковое число клеток суспензии, приготовленной из костного мозга облученной и контрлатеральной голени эксплантировали в пластиковые флаконы. Культивирование продолжалось в течение 10—12 дней — времени, когда формирование колоний в культурах заканчивается. Подсчет числа колоний, выросших в культурах костного мозга облученных и контрлатеральных голеней, выявил двукратное увеличение численности ММСК костного мозга облученной голени при мощности 0,2 Вт и ее подавление при мощности, превышающей 0,6 Вт. Такое поведение может быть объяснено гормезисным эффектом.
Ключевые слова: мультипотентные стромальные клетки костного мозга, лазерное излучение
ВВЕДЕНИЕ
Разработка методов активации пролифе-ративных и дифференцировочных потенций клеток для ускорения формирования и регенерации тканей является одной из ключевых задач тканевой инженерии. С этой целью традиционно используются различные ростовые факторы, ускоряющие пролиферацию и метаболизм клеток. В последнее время на ткани и клеточные культуры воздействуют также различными физическими факторами, способными стимулировать деятельность клеток. Для оказания физического воздействия используют ионизирующее излучение в малых дозах, низкоинтен-
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамален РАМН. E-mail: rubenchail@yandex.ru
сивное световое излучение видимого и ближнего ИК-диапазонов, КВЧ-излучение и т.д. К настоящему времени предложены механизмы, объясняющие стимулирующее действие низкоинтенсивного излучения на клетки тканей и организмы в целом, однако, до сих пор все они остаются дискуссионными [1].
В случае локального нагрева тканей лазерным излучением возможно также изменение гомеостаза вследствие температурного шока или некроза клеток. Это должно вызвать соответствующие реакции организма, направленные на восстановление нарушенных тканей, прежде всего, благодаря активации пролиферации и метаболизма интактных клеток в прилегающих областях. Подобное действие оказывает ионизирующее излучение, создавая на своем пути треки поврежденных клеток. Известно, что оно имеет гормезисный характер — то есть, стимулирует деятель-
ность клеток и организмов при малых дозах и подавляет ее при повышении дозы. Аналогичный отклик можно ожидать при фрагментарном повреждении тканей лазерным излучением [2]. В течение последних нескольких лет фрагментарный фототермолиз лазерным излучением с длиной волны 1,56 мкм активно развивается и успешно используется для омоложения кожи [3]. Локальный лазерный нагрев межпозвоночного диска стимулирует его регенерацию и позволяет избавиться от межпозвоночной грыжи, стабилизировать позвоночник с помощью прокола пункцион-ной иглой [4].
В данной работе представлены результаты исследования локального теплового воздействия ИК лазерного излучения на мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга голени крыс in vivo. Свойства этих клеток и связанные с ними биологические процессы интенсивно изучаются в настоящее время. В частности, стали появляться работы, в которых исследуется влияние низкоинтенсивного лазерного излучения ближнего ИК-диапазона на пролиферацию ММСК в культуре ткани [5]. С помощью метода избирательного клонирования в конце 60-х годов прошлого столетия в лаборатории иммуноморфологии НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи нами была открыта уникальная категория стромальных клеток, а именно — клоногенные стромальные клетки-предшественники [6 — 7]. Стромальные клети составляют 1—3% среди клеток костного мозга и в суспензии кроветворных клеток они сильно разобщены клетками других типов. При эксплантации взвеси костномозговых клеток в монослойные культуры через 10—12 дней в них образуются видимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из нескольких тысяч фибробластов. С помощью хромосомного анализа были получены доказательства клональной природы колоний. Это позволило определить содержание этих клеток в органах кроветворения и иммунитета, изучить изменение их численности при различных патологических состояниях организма или воздействии на организм (облучение, иммунизация , травма и т.д.) [8].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Действие лазерного излучения на стромальные клетки-предшественники костного мозга in vivo исследовалось на самцах крыс породы
Wistar массой 100—120 г. Была разработана модель, при которой под эфирным наркозом стерильно обнажалась большеберцовая кость (голень) крысы. Через эту кость в 10 точках верхней трети голени производили облучение костного мозга. Точки воздействия располагались на расстоянии 1 мм друг от друга по двум параллельным линиям, расположенным вдоль оси кости. Облучение осуществляли посредством оптического волокна диаметром 0,6 мм, контактирующего с поверхностью кости. В качестве источника излучения использовался волоконный лазер, излучающий на длине волны 1,56 мкм. Мощность лазерного излучения на выходе из оптического волокна варьировалась в пределах 0,1 — 1,2 Вт. Длительность лазерного импульса составляла 0,5 с и оставалась постоянной во всех экспериментах. Животные были разделены на 4 группы, для которых выбирались различные выходные мощностью лазера при облучении: 0,1, 0,2, 0,6 и 1,2 Вт. В каждой серии экспериментов лазерному облучению одной дозой подвергали 3-х крыс. Всего было проведено 5 серий экспериментов.
На 3-й день после воздействия лазером животных усыпляли эфиром, выделяли боль-шеберцовые кости, подвергшиеся облучению и контрлатеральные, необлученные голени, которые использовались в качестве контроля. В каждой серии опытов, из костного мозга голеней 3-х крыс, подвергшихся лазерному излучению одинаковой мощности, готовили общую суспензию клеток костного мозга. Аналогичным образом готовили суспензию клеток костного мозга контрлатеральных голеней тех же крыс. 5 • 105 клеток каждой суспензии эксплантировали в пластиковые культуральные флаконы (Nunc) площадью 25 см2, содержащие 5 мл полной культураль-ной среды, состоящей из 80% средыа-MEM (Sigma), 20%-сыворотки эмбрионов коров (HyClone) и антибиотиков. Культивирование проводили при 37 °С в атмосфере 5% CO2. На 10—12 день культивирование прекращали, флаконы дважды промывали физиологическим раствором, фиксировали 70% этанолом в течение 30 — 45 мин, окрашивали по Гимза и под бинокулярной лупой подсчитывали число выросших колоний. Измеряемым параметром являлась колониеобразующая активность ММСК, то есть отношение числа колоний, образовавшихся из суспензий облученного и необлученного костного мозга к числу экс-плантированных клеток. При этом результаты
экспериментов, проведенных в разных сериях, усреднялись для одинаковых групп, и вычислялось стандартное отклонение от среднего значения. Случайный разброс отношения числа колоний при фиксированной мощности излучения составлял примерно 30%.
Предварительно была изучена динамика роста температуры в костном мозге in vitro при лазерном облучении в условиях, моделирующих выше описанный эксперимент. В ходе этого исследования голень крысы выделяли из организма и внутрь трубчатой кости через небольшое боковое отверстие вводили термопару, диаметром 0,125 мм, так, чтобы ее чувствительный конец располагался напротив оптического волокна, которое прислонялось к трубчатой кости с внешней стороны перпендикулярно поверхности. Термопара закреплялась на трехмерном микрометрическом столике. Путем продольных и поперечных перемещений столика определялась область максимального нагрева.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены измеренные зависимости разности текущей и начальной температуры от времени в области максимального нагрева при длительности лазерного импульса 0,5 с и различных мощностях лазера. Видно, что кратковременный рост температуры происходит в течение лазерного импульса при последующем охлаждении до исходной температуры. Так, при мощности
лазерного излучения 0,2 Вт максимальный рост температуры составляет примерно 22 °C. Это значит, что температура костного мозга голени крыс in vivo достигнет в некоторой локальной области примерно 60 °C с учетом температуры тела. Такого нагрева вполне достаточно, чтобы вызвать локальный тепловой шок или некроз клеток ткани. При увеличении мощности лазерного излучения до 0,7 Вт температура костного мозга растет уже примерно на 44 °C.
Зависимость относительного изменения числа стромальных стволовых клеток в костном мозге голени крыс при фрагментарном тепловом лазерном воздействии представлена на рисунке 2 как функция мощности лазерного излучения. При мощности излучения 0,1 Вт выявляется некоторое уменьшение числа колоний в обработанных лазерным излучением образцах, однако, учитывая значительную дисперсию (30%), достоверность этого вывода недостаточно высока (р < 0,2). При мощности излучения 0,2 Вт наблюдается примерно двукарное увеличение числа колоний, что с достоверностью р < 0,01 доказывает повышение колониеобразования в сравнении с контрольными образцами. Следующая экспериментальная точка при 0,6 Вт показывает уменьшение колониеобразования отно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.