научная статья по теме ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА СФИНГОЛИПИДОВ НА ИНСУЛИН-ИНДУЦИРОВАННОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ И СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ СТАРЫХ КРЫС Химия

Текст научной статьи на тему «ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА СФИНГОЛИПИДОВ НА ИНСУЛИН-ИНДУЦИРОВАННОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ И СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ СТАРЫХ КРЫС»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 132 - 141

УДК 577.115.4;577.175.72;612.67

ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА СФИНГОЛИПИДОВ НА ИНСУЛИН-ИНДУЦИРОВАННОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ И СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ СТАРЫХ КРЫС

© 2015 Н.А. Бабенко*, В.С. Харченко

Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, НИИ биологии, 61022 Харьков, пл. Свободы, 4, Украина; факс: +38(057)335-2923, электронная почта: babenko@univer.kharkov.ua

Поступила в редакцию 06.06.14 После доработки 06.08.14

Сфинголипиды играют важную роль в развитии резистентности клеток-мишеней к действию инсулина. Наиболее активными ингибиторами сигнальной трансдукции инсулина являются церамиды, уровень которых существенно повышается в клетках под действием стресса и в процессе старения. В настоящей работе изучена роль различных звеньев метаболизма сфинголипидов в развитии инсулинорезистентности клеток печени в старости. Ингибирование одного из ключевых ферментов синтеза (серинпальмитоилтрансферазы или церамидсинтазы) или деградации сфинголипидов (кислой или нейтральной сфингомиелиназы — СФМазы) с помощью специфических ингибиторов (мириоцина, фумонизина В1, имипрамина и GW4869) сопровождалось снижением содержания церамида и частичным улучшением ответа клеток на действие инсулина в гепатоцитах старых животных. Имипрамин и GW4869 снижали активность кислой и нейтральной СФМазы соответственно в клетках печени старых крыс. Синтез церамида и СФМ снижался при действии мириоцина или фумонизина В1 в «старых» гепатоцитах. При совместном действии ингибиторов происходило восстановление содержания церамида и СФМ и регуляции инсулином метаболизма глюкозы в инсулин-резистентных клетках. Полученные данные свидетельствует о важной роли как вновь синтезированных церамида и СФМ, так и церамида, образующегося в результате деградации СФМ, в развитии резистентности гепатоцитов к действию инсулина в старости.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гепатоциты, инсулинорезистентность, старение, мириоцин, фумонизин В1, имипрамин, GW4869.

Сфинголипиды представляют собой класс биологически активных молекул, вовлеченных в регуляцию физиологических процессов, таких как рост клеток, апоптоз, аутофагия, ангиоге-нез, воспаление и нейродегенерация. Сфинголипиды играют важную роль в развитии резистентности клеток-мишеней к действию инсулина. Модуляция содержания сфинголипидов в тканях-мишенях действия инсулина в условиях in vivo и в экспериментах на культивируемых клетках, как правило, сопровождается измене-

Принятые сокращения: СФМ — сфингомиелин, СФМаза — сфингомиелиназа, GW4869 — специфический неконкурентный ингибитор нейтральной СФМазы, СПТ — серинпальмитоил-СоА-трансфераза, ФЛД — фосфолипаза Б, АМ/РКВ — протеинкиназа В, шТОЯ — мишень рапами-цина у млекопитающих, ГЛЮТ — транспортер глюкозы, ФНО-а — фактор некроза опухоли альфа, ИЛ — интерлей-кин.

* Адресат для корреспонденции.

нием их чувствительности к действию гормона. Наиболее активными ингибиторами различных звеньев сигнальной трансдукции инсулина являются церамиды и ганглиозиды. Инсулинорезистентность, индуцированная высококалорийной диетой или инфузией липидов, сопровождается накоплением в мышечной ткани и печени не только предшественника синтеза сфинго-липидов de novo — пальмитиновой кислоты, но и церамида [1, 2], в то время как ингибиторы ключевого фермента синтеза сфинголипидов (СПТ) — мириоцин и циклосерин — препятствуют накоплению церамида и нормализуют гомеостаз глюкозы в организме. С помощью легко проникающих в клетки аналогов церамида показано, что в мышечной ткани церамиды ингибируют важное звено сигналинга инсулина, а именно протеин-киназу Akt/PKB (ЕС 2.7.11.1) посредством подавления транслокации фермента в плазматические мембраны и/или дефосфорилирования

протеинкиназы под действием протеинфосфа-тазы Р2 (ЕС 3.1.3.16), являющейся мишенью це-рамида в различных клетках [3, 4]. Установлена важная роль церамидов в нарушении ФЛД-за-висимого сигналинга инсулина в клетках печени старых крыс [5]. Подавление синтеза сфин-голипидов de novo с помощью мириоцина нивелирует возрастное нарушение регуляции инсулином активности ФЛД (ЕС 3.1.4.4), но не восстанавливает до уровня молодых животных уровень церамидов и индукцию обмена глюкозы инсулином в клетках печени старых крыс [5].

Экзогенные ганглиозиды GM3 ингибируют фосфорилирование тирозина инсулинового рецептора и субстрата 1 инсулинового рецептора (IRS-1) в адипоцитах 3T3 L1 [6]. Различные ингибиторы синтеза глюкозилцерамидов [7, 8], так же как и нокаут ферментов [9] в клетках мышечной ткани и печени, усиливают стимуляцию инсулином фосфорилирования инсулинового рецептора, протеинкиназы Akt/PKB и mTOR. В то же время нарушение синтеза и снижение содержания СФМ, но не ганглиозидов GM3 в печени, мышечной и жировой тканях и плазматических мембранах клеток печени мышей, характеризующихся дефицитом СФМсинтазы 2 (ЕС 2.7.8.27) или 2-й субъединицы СПТ (ЕС 2.3.1.50), является важной причиной увеличения чувствительности тканей к действию инсулина [10]. Важным представляется то, что содержание церами-да повышается в печени и мышечной ткани, не изменяется в плазматических мембранах клеток печени СФМсинтаза-дефицитных животных и существенно снижается в мембранах СПТ нока-утных мышей. Учитывая эти данные и результаты других исследований [11, 12], можно предположить, что церамиды и ганглиозиды не являются единственными медиаторами в развитии инсулинорезистентности в тканях-мишенях.

Повышение содержания СФМ в плазматических мембранах адипоцитов и эритроцитов предшествует развитию резистентности к действию инсулина и гиперинсулемии у пациентов с ожирением [13]. Дефицит СФМсинтазы 2 и нарушение синтеза СФМ у нокаутных животных предотвращают индукцию под действием высокожировой диеты ожирения и инсулиноре-зистентности [14]. Подавление экспрессии СФМсинтазы с помощью siRNA также снижает в клетках HepG2 содержание больших липид-ных капель и триацилглицерина в печени леп-тин-дефицитных мышей ob/ob. СФМсинтаза 2 локализована в липидных микродоменах и частично ассоциирована с транспортером жирных кислот — CD36/FAT и кавеолином 1. Поскольку СФМсинтаза 2 модулирует содержание СФМ в липидных платформах, авторы приходят к зак-

лючению, что именно конформационные изменения мембран опосредуют участие фермента в регуляции процесса ожирения и диабета 2 типа. Учитывая то, что СФМ является компонентом липидных рафтов, играющих важную роль в компартментализации инсулинового сигналин-га, можно полагать, что изменение содержания СФМ и упорядоченности липидного бислоя плазматических мембран является важной причиной нарушения сигнальной трансдукции инсулина.

В настоящее время остаются нерешенными вопросы, какие именно сфинголипиды и нарушение каких звеньев метаболизма сфинголипи-дов играют ключевую роль в развитии инсули-норезистентности в клетках печени в старости. Ввиду этого целью настоящей работы явилось изучение действия специфических ингибиторов ферментов синтеза и деградации СФМ и цера-мида на способность старых клеток печени адекватно отвечать на действие инсулина.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крысах-самцах линии Вистар. Гепатоциты выделяли по методу Петренко с соавт. [15]. Нативность клеток оценивали с помощью трипанового синего. Выживаемость клеток составила 90—96%. Све-жевыделенные гепатоциты ресуспендировали в среде Игла (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Россия), содержавшей 10%-ную эмбриональную сыворотку (ООО «БиолоТ», Россия), 20 мМ Hepes, пенициллин (61 мг/л), стрептомицин (100 мг/л), до 4 • 107 клеток/мл, и инкубировали в течение 3 ч при 37°. После инкубации гепатоциты отмывали буфером Кребс—Хенселейт с 0,1% БСА («Sigma», США) и разводили перед началом эксперимента в том же буфере. Для ингибирования синтеза церамида de novo гепатоциты 24-месячных крыс инкубировали в течение 2 ч при 37° в присутствии 5 мкМ мириоцина или 1 мкМ фумонизина В1 («Sigma», США). Синтез церамидов изучали в присутствии [14С] пальмитиновой кислоты (1 мкКи/мл, 56 мКи/мМ, «Amersham», «GE Health Care», Великобритания). Для ингибирования кислой и нейтральной СФМзы гепатоциты 24-месячных крыс инкубировали в течение 2 ч при 37° в присутствии 50 мкМ имипрамина («Sigma», США) или 5 мкМ GW4869 («Sigma-Aldrich», Германия) соответственно. В отдельных случаях клетки инкубировали в присутствии ингибиторов как синтеза, так и деградации сфинголипидов.

Ддя определения активности СФМаз (ЕС 3.1.4.12) гепатоциты лизировали в буфере, содержавшем 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl2, 0,65%-ного тритона Х-100 (для последующего определения активности нейтральной СФМазы), или в буфере, содержавшем 50 мМ CH3COONa (pH 5,0), 0,65%-ного тритона Х-100 (для последующего определения активности кислой СФМазы). Реакционная смесь содержала 1,5 мг белка и 0,74 нмоль СФМ [метил-14С-хо-лин]сфингомиелина (52 мКи/мМ, «PerkinElmer», США) в конечном объеме 200 мкл. Пробы инкубировали в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением 1,5 мл смеси CHCl3: CH3OH (1 : 2 v/v) с последующим добавлением 1 мл CHCl3 и 1 мл Н2О. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. После разделения фаз аликвоты верхней и нижней фаз, содержавшие [14С]фос-форилхолин и [14С]СФМ соответственно, использовали для определения радиоактивности. Активность фермента выражали в нмолях продукта или субстрата на 1 мг белка за 1 ч.

Немеченые 14С-гепатоциты использовали для изучения индуцированного инсулином (инсулин свиной монокомпонентный, «Индар», Украина) поглощения 2-Б-[3Н]-глюкозы (0,5 мкКи/мл) и включения Б-[и14С]-глюкозы (0,1 мкКи/мл) в гликоген по методу, описаному Брутман-Бара-зани с соавт. [16]. Гепатоциты предварительно инкубировали в присутствии ингибиторов обмена сфинголипидов или без них в течение 2 ч. Затем отмывали от добавок буфером HBS (HEPES-buffered saline), содержавшим 20 мМ HEPES, и инкубировали в том же буфере в течение 30 мин в присутствии 10 нМ инсулина (или 0,9%-ным NaCl в качестве контроля к инсулину), затем отмывали буфером HBS, разводили в нем же, добавляли 0,5 мкК

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»