УДК 577.355.2
ДЕЙСТВИЕ КАТИОННОГО ПЛАСТОХИНОНА SkQ1 НА ЭЛЕКТРОНТРАНСПОРТНЫЕ РЕАКЦИИ В ХЛОРОПЛАСТАХ И МИТОХОНДРИЯХ ИЗ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА*
© 2015 В.Д. Самуилов**, Д.Б. Киселевский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119991; факс: +7(495)939-3807, электронная почта: vdsamuilov@mail.ru
Поступила в редакцию 14.08.14 После доработки 04.12.14
Пластохинон, связанный с проникающим через мембраны катионом децилтрифенилфосфония (8кр1), в наномолярных концентрациях подавляет образование Н2О2 в клетках эпидермиса из листьев проростков гороха, регистрируемое по флуоресценции 2',7'-дихлорфлуоресцеина. Фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах, выделенных из листьев гороха, подавляется 8кр1 в микромолярных концентрациях: перенос электронов в хлоропластах при функционировании фотосистем II или I (с кремнемолибдатом или метилвиологеном в качестве акцепторов электронов соответственно) более чувствителен к 8кр1, чем при функционировании фотосистем II + I (с феррицианидом или п-бензохиноном в качестве акцепторов электронов). 8кр1, восстановленный боргидридом, окисляется феррицианидом, п-бензохиноном и, в меньшей мере, кремнемолибдатом, но не метилвиологеном. 8кр1 не эффективен как акцептор электронов, поддерживающий выделение О2 из воды в освещенных хлоропластах. Данные о подавлении фотосинтетического выделения или поглощения О2 показывают, что 8кр1, подобно феназинметосульфату, вызывает переход ре-докс-цепи хлоропластов из режима нециклического переноса электронов в циклический режим без выделения О2. Окисление МАЭН или сукцината в митохондриях из корней гороха стимулируется 8кр1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: программируемая клеточная смерть, митохондриально-направленные хиноны, 8кр1, перенос электронов, торможение в хлоропластах, стимуляция в митохондриях.
Программируемая клеточная смерть (ПКС) — физиологический процесс саморазрушения клетки. Митохондрии играют важную роль в ПКС как поставщики активных форм кислорода (АФК) и ряда апоптогенных факторов, включая цитохром с и флавопротеин А!Р [1]. У растений в ПКС участвуют хлоропласты [2, 3], обеспечивающие процесс АФК и (предположительно) активирующие специфическую протеинкиназу, регулируемую редокс-состоянием хинонов.
Генерируя мембранный потенциал (Лу) со знаком «минус» в матриксе, митохондрии аккумулируют катионы, проникающие через мембраны, в частности, катионы метилтрифенилфосфо-
ния [4]. Митохондрии избирательно поглощают МйоР — убихинон, ковалентно связанный с проникающим катионом децилтрифенилфосфония (ДТФФ+) [5]. Взаимодействуя с дыхательной цепью митохондрий, МйоР проявляет себя как эффективный антиоксидант, который предотвращает перекисное окисление мембранных липи-дов и обладает антиапоптозным действием [5—7].
Синтезирован новый ряд антиоксидантов, составленных из пластохинона, проникающего катиона и деканового или пентанового линкера [8], - 10-(6'-пластохинонил)-ДТФФ+ (8кр1), 10-(пластохинонил)децилродамин 19 (8крМ) и 10-(б'-метилпластохинонил)-ДТФФ+ (8кр3).
Принятые сокращения: Аск — аскорбат; АФК — активные формы кислорода; БХ — я-бензохинон; ДТФФ+— катион децилтрифенилфосфония; МВ — метилвиологен; ПКС — программируемая клеточная смерть; СГ — салицилгидрокса-мат; ТМФД — М,М,№,№-тетраметил-я-фенилендиамин; УК — устьичные клетки; ФМС — феназинметосульфат; ЭК — эпидермальные клетки; DCF — 2',7'-дихлорфлуоресцеин; FeCy — феррицианид; MitoQ — 10-(6'-убихинонил)децилтрифе-нилфосфоний; SiMo — кремнемолибдат; SkQl — 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний; SkQ3 — 10-(6'-метил-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний; SkQRl — 10-(пластохинонил)децилродамин; А^ — трансмембранная разность электрических потенциалов.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-231, 22.02.2015. ** Адресат для корреспонденции.
3
489
Они проявляют антиоксидантные свойства в пико- и наномолярных концентрациях, а в более высоких, микромолярных, концентрациях являются прооксидантами. Антиоксидантная активность меняется в ряду 8кр1 = 8крШ > 8кр3 > > Мкор. Катионные хиноны восстанавливаются комплексами I и II дыхательной цепи митохондрий, т.е. являются регенерируемыми анти-оксидантами многократного действия [8].
Цианид индуцирует гибель клеток в эпидермисе из листьев растений, регистрируемую по разрушению клеточных ядер. Эпидермис — монослой из замыкающих клеток устьиц (устьич-ных клеток — УК), содержащих митохондрии и хлоропласты, и основных клеток эпидермиса (эпидермальных клеток — ЭК), содержащих только митохондрии. Разрушение ядер УК и ЭК, вызванное СМ- в качестве индуктора ПКС, предотвращается катионными хинонами [9]. Перенос электронов в освещенных тилакоидах хлоропластов генерирует Лу со знаком «плюс» внутри, поэтому хиноны, связанные с проникающими катионами, не будут накапливаться в энергизованных хлоропластах, напротив, будут выбрасываться из них. Действительно, защитное действие ДТФФ+-производных хинонов отсутствует при освещении [9].
Будут ли катионные хиноны оказывать действие на хлоропласты? Цель настоящей работы - испытать влияние пластохинона, кова-лентно связанного с ДТФФ+ (8кр1), на перенос электронов в хлоропластах из листьев и митохондрий из корней проростков гороха.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проростки гороха (Pisum sativum L. сорта Альфа) выращивали 7—15 сут при периодическом освещении светом металлогалогеновой лампы ДРиЗ (250 Вт) интенсивностью ~100 ^E • м-2 • с-1 (свет — 16 ч, темнота — 8 ч) при 20-24°.
Хлоропласты выделяли, как описано ранее
[10], из листьев проростков растиранием в фарфоровой ступке в среде, содержащей 50 мМ Трицин-KOH, 35 мМ NaCl и 0,4 М сахарозы, рН 7,8, отмывали и суспендировали в той же среде. Митохондрии выделяли, как описано
[11], из корней проростков гороха, растирали их в ступке, затем отмывали и хранили, как и хло-ропласты, в среде того же состава. Хлоропласты и митохондрии хранили при 4° и использовали в течение 3—4 ч после выделения. Содержание хлорофилла в хлоропластах измеряли методом Арнона [12], содержание белка в митохондриях определяли с помощью бицинхониновой кислоты и сульфата меди [13].
Образование АФК в клетках из листьев проростков гороха оценивали по флуоресценции 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF). Флуоресценцию DCF возбуждали лучом лазера при 488 нм и регистрировали при 500—530 нм с помощью микроскопа Axiovert 200M с конфокальной приставкой LSM 510 Meta («Carl Zeiss», Германия).
Светозависимое выделение О2 хлоропласта-ми и поглощение О2 митохондриями гороха измеряли полярографически с закрытым платиновым электродом. Для освещения хлоропластов использовали сфокусированный свет галогеновой лампы (250 Вт) с интенсивностью ~11,4 мЕ • м- 2 • • с-1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Рис. 1 показывает образование Н2О2 в УК и ЭК листьев гороха, регистрируемое по флуоресценции БСЕ Нефлуоресцирующий 2',7'-дихлор-флуоресцин (БСРИ) в клетках окисляется до флуоресцирующего БСБ посредством Н2О2 ферментативно (с участием пероксидазы) или неферментативно (в присутствии Н2О2 + Бе2+) [14]. БСБИ окисляется также ОН', СО1 и медленнее N02, но не 01 [15]. В УК БСБ преимущественно флуоресцирует в хлоропластах, в ЭК - в сферических структурах, представляющих собой митохондрии [16], и вдоль плазматических мембран, содержащих генерирующую АФК МАБРИ-оксидазу [17]. 8кр1 тушит флуоресценцию БСБ в УК и ЭК (рис. 1), предотвращая образование Н202.
Для исследования действия 8кр1 на нециклический перенос электронов в хлоропластах были испытаны различные участки фотосинтетической редокс-цепи. Выделение 02 хлороплас-тами с кремнемолибдатом (81Мо: И48Ю4 • 12Мо03 • • И20) в качестве акцептора электронов осуществляется фотосистемой II, устойчивой к диуро-ну, ингибитору переноса электронов на уровне вторичного пластохинона рв фотосистемы II: 81Мо вытесняет диурон с участка его связывания и восстанавливается первичным пластохи-ноном рА фотосистемы II [18]. Фотосистема I была задействована с помощью электрон-до-норной пары аскорбата (Аск) и М,М,№,№-тетра-метил-«-фенилендиамина (ТМФД), взаимодействующего с ¿/-цитохромным комплексом, пластоцианином и комплексом реакционного центра фотосистемы I. В качестве акцептора электронов был использован метилвиологен (МВ), который, восстанавливаясь преимущественно Бе8-центром Бв [19] редокс-цепи фотосистемы I, самопроизвольно окисляется 02. В итоге перенос электронов от пары ТМФД + ас-
* ^ Г $ ' Т I %
Т • Ж- V »
* • *У | . - .. - » ,
%. *
\ . х
Г. ■•{ ■
• * "« * »
Рис. 1. Действие 8кр1 на выход флуоресценции БСБ в УК и ЭК листьев гороха. К кусочкам листьев добавляли 100 нМ 8кр1, инкубировали 1 ч, окрашивали 20 мкМ диацетата 2',7'-дихлорфлуоресцина в течение 20 мин; флуоресценцию БСБ регистрировали у края кусочков листовой пластинки. На изображениях — суммарная картина (максимальная проекция) флуоресценции БСБ с 20 оптических срезов, удаленных один от другого на 1 мкм. Масштабная линейка — 10 мкм. Флуоресценцию БСБ возбуждали светом с длиной волны 488 нм и регистрировали при 500—530 нм
корбат на метилвиологен и далее на О2 приводит к поглощению О2 освещенными хлоропластами. 8к01 подавляет нециклический перенос электронов как в фотосистеме II, так и в фотосистеме I (рис. 2, а), полумаксимальная концентрация а50) для 8к01 составляет около 2—3 и 10—20 мкМ соответственно.
Фотосинтетическое выделение О2 хлороплас-тами с феррицианидом (БеСу) или п-бензохи-ноном (БХ) устойчиво к 8к01 вплоть до концентрации 20 и 50 мкМ соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации 8к01 подавляет выделение О2 с около 50—60 и 90—100 мкМ соответственно (рис. 2, б). Различия в чувствительности переноса электронов с испытанными парами акцепторов электронов к 8к01, по-видимому, связаны не только с их редокс-свой-ствами.
Так, 8к01, восстановленный боргидридом №ВН4, окисляется феррицианидом, п-бензохи-ноном и в меньшей степени 81Мо, но не метил-виологеном (рис. 3). Более низкая скорость окисления кремнемолибдатом может быть обусловлена его структурными особенностями. Вариант с метилвиологеном сходен с самопроизвольн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.