УДК 577.23
ДЕЙСТВИЕ МЕЛАТОНИНА НА СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННОЕ ОТКРЫТИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПОРЫ В МИТОХОНДРИЯХ МОЗГА
КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ © 2014 г. О. В. Крестинина*, Ю. Л. Бабурина, Т. С. Азарашвили
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Московская обл., Пущино, Институтская ул., 3; *электронная почта: krestinina@rambler.ru Поступила в редакцию 13.05.2013 г.
Окислительный стресс является важным фактором, воздействующим на различные органы при старении. Митохондрии считаются источником эндогенных оксидантов, концентрация которых может поддерживаться на низком уровне благодаря антиоксидантным ферментам. В настоящее время считается, что процессы старения тесно связаны с митохондриальной дисфункцией, одной из причин которой может быть повышение чувствительности митохондрий к активации открытия неспецифической поры (mitochondrial permeability transition pore, мРТР) во внутренней мембране митохондрий. В настоящее время широко изучается влияние природного антиоксиданта мелатонина, содержание которого в организме снижается при старении. В настоящей работе исследовали влияние мелатонина на характеристики стресс-индуцированной неселективной поры митохондрий, изолированных из крыс (старых и молодых), подверженных хронической обработке мелатонином путем орального введения. Окислительный стресс индуцировали, используя 1 и 100 мкМ гидропе-роксида кумола. Было обнаружено, что хроническое введение мелатонина способствовало замедлению индукции неспецифической поры в митохондриях, изолированных из старых крыс, обработанных мелатонином. При исследовании влияния гидропероксида кумола на набухание митохондрий крыс, обработанных мелатонином, было выявлено, что мелатонин способен предотвращать набухание митохондрий, стимулированное гидропероксидом кумола.
Ключевые слова: митохондрии, мелатонин, пора неспецифической проницаемости, старение, окислительный стресс.
Б01: 10.7868/80233475514020030
Наиболее общепринятой теорией старения является свободно-радикальная теория, которая считает основной причиной старения активные формы кислорода (АФК) или азота (АФА), вызывающие окислительный стресс, который приводит к нарушению процессов жизнедеятельности клеток и их гибели. Активные формы кислорода участвуют в регуляции активности ферментов, передачи сигналов и транскрипции генов. Окислительное повреждение макромолекул, входящих в состав различных систем, увеличивается с возрастом, что предполагает связь этого процесса со старением и возраст-зависимыми заболеваниями. В настоящее время установлено, что старение тесно связано с нарушением функций митохондрий, вызванным активными формами кислорода, поскольку митохондрии являются основным источником АФК в клетках [1, 2]. Вследствие этого генерацию АФК рассматривают как фактор, определяющий продолжительность жизни [3].
Разрушительное действие АФК сдерживается функционированием защитных систем, к которым относятся как ферментативные (супероксид-дис-мутаза (SOD), глутатионпероксидаза (ОРх)/глута-тионредуктаза (GRd), каталаза), так и неферментативные соединения (баланс восстановленного/окисленного глутатиона (GSH/GSSG)). Таким образом, можно предполагать, что старение связано с изменением баланса окислительно-восстановительного статуса в митохондриях [4, 5], а анти-оксидантные ферменты предохраняют биологические макромолекулы и ткани от окислительных повреждений [6]. Обнаруженное ослабление анти-оксидантной защиты во время старения сопряжено с дисфункцией митохондрий и развитием программируемой гибели клеток [7]. Причиной клеточной гибели, обусловленной нарушением функций митохондрий, может служить неспецифическое увеличение проницаемости внутренней мембраны (permeability transition), возникающее
вследствие повышения уровня кальция в мито-хондриальном матриксе до сверхпорогового значения или в результате повреждающего действия свободных радикалов [8]. Увеличение проницаемости внутренней мембраны ведет к формированию в митохондриях неселективной поры (permeability transition pore, мРТР), которая способна пропускать соединения с молекулярной массой 1.5 кДа. В этих условиях в митохондриях наблюдается разобщение дыхания и фосфорилирова-ния, ингибирование АТР-синтетазной активности, активация АТР-азной активности, и как следствие, увеличение гидролиза АТР [9]. Кроме того, индукция мРТР приводит к освобождению апоптогенных факторов (цитохром с, апоптоз-индуцирующий фактор и эндонуклеаза G) [10]. Результаты многих исследователей показывают, что митохондрии, изолированные из старых животных, обладают более низкой пороговой концентрацией ионов кальция, т.е. более чувствительны к открытию поры. Однако длительное введение животным природного антиоксиданта мелатонина улучшает функциональное состояние митохондрий [11].
Мелатонин является одним из известных и широко изучаемых антиоксидантов. Это гормон, который вырабатывается шишковидной железой путем последовательного 4-стадийного ферментативного превращения триптофана [12]. Синтезированный мелатонин выходит в кровь или спинномозговую жидкость. В крови концентрация мелатонина может достигать 0.5 нМ [12, 13]. Кроме эпифиза, мелатонин образуется и в других тканях и органах, а также в растениях и микроорганизмах [14, 15]. Мелатонин является липофиль-ной молекулой, которая проникает через клеточные мембраны и легко попадает в субклеточные структуры [16], включая ядра и митохондрии, причем в последних его концентрация может в 100—200 раз превышать концентрацию в цитозоле [17, 18]. С увеличением возраста синтез мелатонина значительно снижается [19], вследствие этого увеличивается содержание свободных радикалов [20]. Предполагается, что мелатонин может играть значительную роль в поддержании мито-хондриального гомеостаза и повышении эффективности электронного транспорта [21]. Данные о состоянии антиокидантных систем в процессе старения противоречивы. С одной стороны, было найдено, что уровень глутатиона (GSH), SOD и GPx в мозге и в митохондриях мозга при старении остается неизменным [22, 23]; также, согласно [6], не изменяется активность фементов супероксид-дизмутазы и глутатионпероксидазы (SOD и GPx). С другой стороны, некоторые авторы показали уменьшение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в мозге и в митохондриях при старении [24, 25]. Существуют и противоположные данные, демонстрирующие, в частности,
увеличение активности Mn-SOD при неизменной активности Cu/Zn-SOD [26, 27]. В более поздних исследованиях было обнаружено повышение активности SOD и GPx в митохондриях, выделенных из старых крыс, подвергавшихся длительной обработке мелатонином [28]. Ранее мы показали, что открытие неселективной поры, индуцируемое сверхпороговыми концентрациями кальция в митохондриях мозга, изолированных из старых животных после длительного хронического введения мелатонина, приводит к увеличению пороговой концентрации кальция и предотвращению увеличения неспецифической проницаемости [11]. В настоящей работе было исследовано влияние хронического введения ме-латонина на стресс-индуцированное открытие неселективной поры в митохондриях мозга, выделенных из молодых и старых животных. Были определены изменения мембранного потенциала, пороговая концентрация ионов кальция и набухание митохондрий. Окислительный стресс индуцировали, используя гидропероксид кумола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящем исследовании митохондрии мозга выделяли из молодых (половозрелых 3-месячных) и старых (18-месячных) крыс.
Выделение митохондрий мозга. Для изучения функционального состояния митохондрий при хроническом введении мелатонина использовали молодых крыс в возрасте 1 мес. и старых крыс, в возрасте 16 мес. Как молодые, так и старые крысы подвергались длительной (в течение 2 мес.) обработке мелатонином. Таким образом, в эксперименте было исследовано 4 группы крыс: группа 1 — молодые крысы, не обработанные мелатонином; группа 2 — молодые крысы, обработанные мелатонином; группа 3 — старые крысы, не обработанные мелатонином; группа 4 — старые крысы, обработанные мелатонином. Обработка мелатони-ном осуществлялась введением его в организм животных с питьевой водой. Животных группы 2 (1-месячные крысы) и группы 4 (16-месячные крысы) в течение 2 мес поили водой с мелатони-ном (хроническое введение мелатонина). Мела-тонин растворяли в питьевой воде из расчета 100 мкг/мл; питьевую воду меняли каждые 2 дня. Объем выпиваемой каждой крысой воды был 33 ± ± 3 мл, что составляло приблизительно 10 мг ме-латонина на 1 кг веса в день. Все группы животных содержались в одинаковых условиях (температура, влажность воздуха, кормление) [29]. Из мозга крыс каждой группы выделяли митохондрии методом Симса [30], модифицированным в нашей лаборатории. Изолированный мозг измельчали, очищали от кровеносных сосудов и разрушали с помощью стеклянного гомогенизатора в десятикратном объеме среды, содержавшей 320 мМ са-
харозу, 10 мМ трис-HCl (pH 7.4), 0.5 мМ K+-EDTA, 0.5 мМ EGTA, 0.2% БСА (0-4°C). Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, осадок удаляли, а супернатант центрифугировали повторно для более полного удаления ядер и поврежденных клеток. Митохондрии осаждали центрифугированием при 12500 g в течение 10 мин при 4°C. Полученный осадок (1.5 мл) смешивали с 3%-ным перколом (1 мл) и далее очищали митохондрии в градиенте перкола (10%—15%—24%), осаждая несинаптические митохондрии при 31300 g в течение 10 мин. Осадок митохондрий промывали средой выделения без EDTA, EGTA и БСА при 11500 g 10 мин и суспендировали в той же среде.
Определение митохондриальных функций. Изменение мембранного потенциала митохондрий оценивали по распределению ионов тетрафенил-фосфония (TPP+) между митохондриальным мат-риксом и инкубационной средой с помощью TPP+-селективного электрода (Нико, Россия). Скорость входа ТРР+ определяли как скорость изменения концентрации ионов тетрафенилфосфо-ния TPP+ (мкМ/мин) на 1 мг митохондриального белка. Скорость входа Са2+ определяли как изменение концентрации (мкМ/мин) на 1 мг митохон-дриального белка. Суспезию митохондрий в инкубационной среде помещали в термостатируемую ячейк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.