ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 449, № 5, с. 610-613
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.112.6+577.175.82+591.512.16
ДЕЙСТВИЕ НОВЫХ АНАЛОГОВ НОЦИЦЕПТИНА НА ПОВЕДЕНИЕ БЕЛЫХ КРЫС
© 2013 г. Е. А. Чеснокова, П. К. Анохин, А. С. Воронкова, Н. Ю. Сарычева, В. А. Дубынин, А. А. Каменский, Л. А. Андреева, академик Н. Ф. Мясоедов
Поступило 21.09.2012 г.
БО1: 10.7868/80869565213110273
Ноцицептин (ноцицептин/орфанин РР), обнаруженный в 1995 г. французскими исследователями эндогенный пептид [1], родственен энкефа-линам и эндорфинам. Как и они, ноцицептин при процессинге вырезается из более длинного предшественника и содержит фенилаланин в 4-й позиции. Однако первой аминокислотой в молекуле ноцицептина является не тирозин, а фенилала-нин. Пептидная цепь ноцицептина состоит из 17 аминокислот: РООРТОАЯКВАЯКЬАМд. При исследовании различных его фрагментов и аналогов выявлено, что первые четыре аминокислоты РООР являются основной действующей частью молекулы, активирующей рецептор [2].
Ноцицептин — специфический эндогенный лиганд рецептора ОЯЬ1 ("орфановый рецептор"). Этот рецептор гомологичен ц-, 8- и к-опиоидным рецепторам. 47% аминокислотной последовательности у всех четырех белков совпадают; если рассматривать только трансмембранные домены, то уровень гомологии выше — 64% [3]. ОЯЬ1 не связывает с достаточной аффинностью типичные опиоидные агонисты и антагонисты. Так, налок-сон практически на него не действует, что служит одним из важнейших отличий между ОЯЬ1 и классическими опиоидными рецепторами [4].
Рецепторы ОЯЬ1 широко представлены в разных областях нервной системы, но наибольшая их концентрация отмечается в стволовых структурах. В связи с этим ноцицептин принимает участие в регуляции локомоции, обучения, стрессового ответа, агрессии, полового поведения, работы вегетативной нервной системы [5]. Отмечается его разнонаправленное действие на болевую чувствительность, тревожность, общую двигательную активность, причем эффект зависит от таких
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва
факторов, как доза, способ введения, вид экспериментальных животных. В ряде случаев механизмы действия ноцицептина рассматриваются как "антиопиоидные" [6]. Показано, что при однократном внутрижелудочковом введении (применяется наиболее часто) ноцицептин подавляет локомоторную активность животных, а также оказывает анксиолитическое действие [4]. Однако есть сообщения об анксиогенных эффектах этого пептида [7]. Предположительно, механизм подавления ноцицептином локомоции связан с торможением дофаминергических нейронов вентральной покрышки [8], а действие на тревожность обусловлено влиянием на серотонинерги-ческие нейроны, что приводит к снижению выброса медиатора в коре больших полушарий [9].
Поскольку ноцицептин обладает широким спектром нейротропной активности, лиганды ОЯЬ1-рецептора представляют значительный интерес для исследователей-физиологов, а также с точки зрения возможного клинического применения. Ранее нами было показано, что амидирован-ный пептид РООР-МИ2 способен воздействовать на поведение крыс при системном введении, вызывая изменения, аналогичные некоторым эффектам природного ноцицептина [10]. Известно также, что присоединение к пептидам последовательностей, состоящих из глицина и пролина, повышает устойчивость молекулы к расщеплению пептидазами и может способствовать более длительному действию на рецепторы [11]. С учетом сказанного в ходе представленной работы были синтезированы и исследованы новые аналоги М-концевого фрагмента ноцицептина: РООР-ОР, РООР-РОР и РООР-УОР. Конкретной целью стало изучение влияния этих пептидов на поведение экспериментальных животных (белых крыс).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на самцах нелинейных белых крыс массой не менее 120 г (п = 72). Пептиды
РООР-МН2, РООР-ОР, РООР-РОР и РООР-УОР вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг за 20 мин до тестирования. Пептиды растворяли в смеси дистиллированной воды и медицинского спирта (соотношение 29 : 1). Животные контрольной группы получали эквивалентный объем растворителя.
Влияние пептидов на двигательную активность и тревожность изучали в тесте открытое поле при ярком свете (лампа 60 Вт, подвешенная над центром арены). Использованное открытое поле представляет собой круглую арену диаметром 100 см с высокими стенками и полом, разделенным двумя концентрическими окружностями и отрезками прямых на 19 равных по площади сегментов (производство фирмы "Открытая наука", Москва). Животное помещали в центр арены и в течение 3 мин визуально оценивали следующие показатели: горизонтальную активность — пробег (по числу пройденных сегментов поля); вертикальную активность (число стоек); количество радиальных перемещений с пересечением внешней окружности (отходы от стенки арены); количество радиальных перемещений с пересечением внутренней окружности (выходы в центр арены); умывания (груминг).
Кроме того, для оценки баланса тревожности и ориентировочно-исследовательской активности животных использовали тесты О-лабиринт и приподнятый крестообразный лабиринт. О-лабиринт представляет собой кольцо (внешний диаметр 105 см, ширина дорожки 10 см), разделенное на четыре равных сектора. Два противоположных сектора имеют высокие боковые стенки. При комнатной освещенности крысу помещали в один из закрытых секторов (он считался "домашним") и регистрировали следующие показатели: латентный период выхода из домашнего сектора; общее время нахождения на открытых секторах; время нахождения в каждом из закрытых секторов; количество выходов на открытые сектора; количество выглядываний из закрытых секторов; количество свешиваний с открытых секторов; число стоек и умываний. Суммарное время регистрации в разных сериях экспериментов составляло 3 или 5 мин. В ряде случаев использовался также приподнятый крестообразный лабиринт. Он представляет собой равносторонний крест (длина лучей 50 см, ширина 15 см), два противоположных рукава которого имеют высокие боковые и торцевые стенки, а оставшиеся два открыты. Открытые рукава освещаются яркими лампами (100 Вт). Животное в начале опыта помещали в освещенный центр установки носом в сторону светлого рукава. В течение 3 мин регистрировали следующие параметры поведения: число стоек и умываний; число выглядываний из темного рукава; число выходов на открытые рукава и концы открытых рукавов; число свешиваний; число пе-
% от контроля 140 120 100 80 60 40 20 0
п Контроль ■ Пептиды
(а)
* Т _1
т
- 1П 00 00 оо
II к , II II к 1 II II к , II к
160 140 120 100 80 60 40 20 0
РООР
Л
РООР-РОР РООР-УОР РООР-ОР
(б)
Л
РООР
РООР-РОР РООР-УОР РООР-ОР
Рис. 1. Влияние пептидов РООР^Н2, РООР-РОР, РООР-УОР и РООР-ОР на горизонтальную (а) и вертикальную (б) активность крыс в тесте открытое поле при внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг за 20 мин до начала наблюдения. Значения представлены в процентах от показателя соответствующей контрольной группы. Достоверные отличия от контроля отмечены * (р < 0.05 по критерию %2).
реходов через центр свет—свет и темнота-темнота". Также отмечали суммарное время на свету и латентный период первого входа в темный отсек.
При статистической обработке данных отличия между группами оценивали с помощью критериев Стьюдента, Манна-Уитни и непараметрического критерия х2. В каждой из статистических групп было не менее 8 животных. Данные на рисунках представлены в виде средних величин (в процентах от значения соответствующей контрольной группы) ± стандартная ошибка среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В тесте открытое поле у крыс, которым вводили пептиды РООР-МН2 и РООР-УОР, было выявлено достоверное уменьшение горизонтальной двигательной активности (пробега) по сравнению с аналогичными показателями контрольных групп (рис. 1а; средняя величина пробега в контроле составила 31.6 ± 3.1 сегмента). При этом значимого изменения таких параметров, как стойки (рис. 1б) и умывания, отмечено не было. Следовательно, пептиды РООР-МН2 и РООР-УОР уменьшают не столько ориентировочно-исследовательскую активность животных, сколько их локомоцию. Кроме того, в группах, получавших РООР-МН2 и РООР-УОР, был снижен латентный период (ЛП) выхода животных из центрального сегмента. В группе РООР-МН2 все крысы вышли из центра в течение первых 50 с, а в
612
ЧЕСНОКОВА и др.
(а)
I
(б)
□ Контроль ■ РООР-УОР
(в)
* * -г
% от контроля 140 120 100 80 60 40 20 0
Рис. 2. Влияние пептида РООР-УОР на поведение крыс в тесте О-лабиринт при внутрибрюшинном введении в дозе 1 мг/кг за 20 мин до начала опыта. В контрольной группе 8 животных, в опытной — 9. По оси ординат: а — число выходов на открытые участки; б — число входов в закрытые сектора; в — суммарное время на открытых секторах. Остальные обозначения, как на рис. 1.
соответствующей контрольной группе у 3 из 15 животных ЛП был больше 50 с (р = 0.08 по критерию х2). В группе РООР-УОР только у 1 из 8 крыс ЛП составил больше 5 с; в контроле ЛП более 5 с наблюдался у 7 животных из 9 (р < 0.01 по критерию х2). Также ни одно животное из группы, получавшей РООР-МИ2 (п = 14), не отходило от стенки арены (в контрольной группе реакцию отхода выполнили 6 крыс из 15; р < 0.01 по критерию х2). Уменьшение таких показателей, как ЛП выхода из центра арены и число отходов от ее стенки, можно рассматривать как признак более высокой тревожности животных после введения пептидов. Вместе с тем крысы, получавшие РООР-УОР, не отличались от контроля по количеству отходов и выходов (р = 0.5—0.9).
В тесте О-лабиринт у животных, которым вводили РООР-УОР, отмечено достоверное уменьшение количества выходов из закрытых отсеков и последующих входов в эти отсеки (рис. 2). Данный факт, как и падение пробега в тесте открытое поле, можно объяснить снижением общей двигательной активности крыс. В этой группе также было уменьшено суммарное время, проведенное на открытых секторах, до 24.9 ± 6.8 с по сравнению с 45.5 ± 10.4 с в контроле (р = 0.12, тест Стью-дента; рис. 2в). Снижение времени пребывания на открытых секторах свидет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.