БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 931-935
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.352.335; 577.352.336
ДЕЙСТВИЕ NT-1505 НА СТРУКТУРУ МЕМБРАН ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА in vivo
© 2015 г. Н .Ю. Герасимов, О .В. Неврова, В.В. Каспаров, А.Л. Коварский,
А.Н. Голощапов, Е.Б. Бурлакова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: n.yu.gerasimov@gmail. сот Поступила в p едакцию 02.07.15 г.
Проведено исследование влияния NT-1505 на мембраны эндоплазматического pетикулума. Показано, что динамика изменений липидной и пр ибелковой областей микр овязкости мембр ан эндоплазматического ретикулума при введении препарата носит антибатный характер, что указывает на отсутствие патологических нарушений в структур е мембр ан. Микр овязкость мембр ан измер яли методом электр онного пар амагнитного резонанса спиновых зондов 2,2,6,6-тетр аметил-4-капр илоилоксилпипер идин-1-оксила (липидный зонд) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетр аме-тил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксила (прибелковый зонд). C целью получения более полной информации об изменениях структур ы мембр ан пр и воздействии нейр опр отектор а NT-1505 измер яли темпер атур ную зависимость вр емени корреляции вр ащательной диффузии в диапазоне темпер атур 283-317 К (10-44°C). Для контр ольной гр уппы были ха р актер ны два структур ных пер ехода в темпер атур ных интер валах 16-20°C и 32-38°C для обеих областей мембр ан, котор ые со хр анялись пр и введении NT-1505. Таким обр азом, NT-1505 не влияет существенно на структуру мембр ан эндоплазматического р етикулума.
Ключевые слова: текучесть мембран, спиновый зонд, структура мембран, липид-белковые взаимодействия.
Болезнь Альцгеймера представляет собой нейр одегенер ативное заболевание, котор ое за -трагивает многие клеточные функции, такие как транспорт ионов, синаптическая передача и др., котор ые так или иначе связаны с функциональным и структур ным со стоянием мем-б р ан. П р актически в се совр еменные тер апевти-ческие стр атегии лечения болезни Альцгеймер а нацелены на одну из многих мишеней - на блокаду кальциевы х каналов или на угнетение ацетилхолинэстеразы, либо на синтез, агрега-цию или дегр адацию в-амилоида. Нам кажется очевидным, что при всех этих воздействиях пр оисходит модификация структур ы мембр ан, котор ая может игр ать важную р оль пр и р аз-витии и тер апии болезни Альцгеймер а.
Р анее нами было показано, что п р и развитии деменции альцгеймеровского типа происходит нарушение структуры мембран, при этом микр овязкость мембр ан р езко снижается [1]. Поэтому мы считаем важным изучение действия препаратов, предлагаемых для терапии болезни Альцгеймер а, на структуру липидного бислоя. Структур ное со стояние мембр ан может изме-
Cокращения: ЭПP - электронный парамагнитный резо-нанс.
няться как из-за изменения со става липидов, так и из-за их пер ер аспр еделения внутр и мембр аны, что может пр оисходить пр и изменении конфор мации мембр анных белков. Как извест -но, синтез белков и липидов пр оисходит на мембранах эндоплазматического ретикулума. Поэтому представляло интерес изучение действия нейр опр отектор а N7-1505 на мембр аны эндоплазматического р етикулума.
ЭК СПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС ТЬ
N7-1505 вводили каждые сутки внутр ибр ю -шинно в концентрации 1мг/кг. Пробы были взяты чер ез 3, 7 и 15 сут после введения. Подопытные животные - самки беспородных мышей массой по 20-23 г.
NT-1505
931
7*
Pис. 1. Типичный ЭПР-спектр для зондов I и II.
Образец представлял собой объединенную фр акцию микр о сом, выделенных из мозга шес-ти-восьми животных, каждую точку измеряли 4-5 р аз. Микр о сомы выделяли методом диф-фер енциального центрифугир ования в сахар о -зе [2].
Текучесть липидного бислоя мембр ан опр е-деляли методом электр онного пар амагнитного р езонанса (ЭП Р) спиновых зондов. В качестве зонда использовали стабильные нитроксильные р адикалы 2,2,6,6-тетр аметил-4-капр илоилоксил-пиперидин-1-оксил (зонд I) и 5,6бензо-2,2,6,6-тетр аметил-1,2,3,4-тет р агидро -у-карболин-3-оксил (зонд II), синтезированные в Институте химической физики им. Н .Н. Семенова Р АН.
В работе [3] показано, что зонд I преимущественно локализуется в поверхно стном слое липидных компонент мембраны, а зонд II - в липидах, прилегающих к белкам, что позволяет по поведению зондов I и II в липидном бислое судить о липид-белковых взаимодействиях в мембр анах. Для удоб ства изложения мы в последующем будем называть зонд I «липидным», а зонд II - «белковым».
Из полученных спектр ов ЭП Р (рис. 1) р ас-считывали вр емя корреляции вр ащательной подвижности (тс), характеризующее микровязкость компонентов мембр аны, по фо р муле тс = 6,65-10-10 х АН+х ((I+/I-)05 - 1), приведенной в р аботе [4]. Регистр ацию спектр ов ЭП Р пр ово-дили в диапазоне температур 283-317 К (10-44°С) на радиоспектр ометр е ER 200D-SRC фирмы Бгискег.
Известное соотношение Стокса-Энштейна (см., например, [5]) связывает параметр тс и вязко сть ср еды, окружающей зонд: тС = цУ/kT, где У - объем радикала (его можно считать прямо пр опор циональным молекуляр ному весу); П - динамическая вязко сть ср еды ; k - постоянная Больцмана и Т - абсолютная темпер атур а. Динамическая вязко сть п связана с темпер атур ой следующим эмпир ическим соотношением п = А/ eb/T [6], откуда следует lnтС = А' + b/T + ln(1/T), где А', А'', b - константы. И сследуемый нами темпер атур ный интер вал (от 283 до 317 К ) достаточно узок, и на его пр о -тяжении ln(1/T) меняется очень незначительно по ср авнению со слагаемым b/T, поэтому можно считать lnтС = a + b/T.
И сходя из этой точки зрения, график зависимо сти 1птс от 1/Т для таких структур должен пр едставлять собой ломаную, точки излома которой являются точками структурных перехо-дов [7]. Наклон этих прямых позволяет определить энер гию активации пер ехода АЕа = bR [8], где b - коэффициент наклона соответствующего прямого участка, а R - универсальная газовая постоянная. Энергия активации соответствует энер гии пер естр ойки одного моля ли-пидов мембр ан [8].
Статистическую обработку данных осуществляли методами пар аметр ической статистики с использованием пакетов компьютер ных пр о -гр амм Mkrosoft® Offiœ Ехсе1 и Origin® 6.1 пр и статистической надежно сти 95%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения абсолютных значений времен корреляции вр ащательной диффузии от введения пр епар ата пр и темпер атур е 297 K показаны на рис. 2. У контрольной группы микровязкость липидных областей мембран оставалась практически неизменной на всем протяжении экс-пер имента, тогда как в пр ибелковых областях наблюдалось увеличение текучести через 7 сут после хр онического введения пр епар ата. Подобные изменения хар актер ны для биологических мембр ан. Обычно в пр оцессе метаболизма в пер вую очер едь пр оисходят изменения стр ук -
ДЕИ C ТВИЕ NT-1505 НА C ТРУКТУРУ МЕМБРАН
Ах,
933
Рис. 2. Зависимости Тс от времени введения N7-1505 для мембр ан эндоплазматического ретикулума пр и темпер атур е 297°К.
P ис. 3. Относительные значения вр емен корреляции вр ащательной диффузии от вр емени введения пр е-парата при 297°К.
тур ы пр ибелковых областей мембр ан, котор ые связаны с функционир ованием мембр анных белков. Вслед за этим изменяются структур а и структур ные хар актер истики липидных областей мембр ан [9]. В данном эксперименте мы не наблюдали никаких изменений в липидной фазе мембр ан контр ольной группы, вер оятно потому, что эти изменения могли происходить в интервалах времени между измеряемыми точками.
В пр ибелковых областях пр и введении пр е-пар ата текучесть мембр ан возр а стала с течением вр емени. Для липидных областей мембр ан эндоплазматического р етикулума было хар актер но падение значений тс пр и длительном введении пр епар ата. Динамика изменений липид-ной и прибелковой областей микровязкости мембр ан эндоплазматического р етикулума носит антибатный хар актер (рис. 2), что указывает на отсутствие патологических нарушений в структуре мембран, так как подобные изменения обычно наблюдаются в норме [9]. Стоит отметить, что хар актер изменений вр емени корр еляции вр ащательной диффузии в пр ибелковых областях мембр ан пр и введении N7-1505 имеет пр отивоположную напр авленность относительно контроля (рис. 2), что также ранее наблюдалось в мембранах синаптосом [10].
Из рис. 3 видно, что пр и хр оническом введении исследуемого нейр опр отектор а чер ез тр ое суток наблюдалось увеличение микр овязкости липидных областей и незначительное увеличение текучести пр ибелковых областей мембр ан эндоплазматического р етикулума. П р и дальнейшем введении N7-1505, чер ез 7 и 15 сут, величина времени корреляции вращательной диффузии в липидной области была ниже кон-
тр ольных значений, тогда как в пр ибелковой -выше. Следует особо подчеркнуть, что относительные изменения микр овязкости пр ибелковых и липидных областей мембр ан эндоплазматического ретикулума имеют разнонапр авленный характер относительно контроля на всех сроках введения пр епар ата (р ис. 3), что хар актер но при отсутствии патологических нарушений стр уктур ы мембр ан [9,10]. К р оме того, отметим, что подобное поведение микровязкости наблюдалось на всем исследуемом температурном интер вале для обоих зондов, что указывает на корректность измерения микровязкости при комнатных темпер атур ах.
С целью получения более полной информации об изменениях структуры мембран при воздействии нейр опр отектор а N7-1505 измеря -ли темпер атур ную зависимость вр емени корреляции в р ащательной диффузии в диапазоне темпер атур 283-317 К (10-44°С). Зависимость 1п тс от 1/Т представляет собой ломаную с наклонными и пр актически гор изонтальными прямыми. Гор изонтальные пр ямые соответствуют тер-моиндуцир ованным стр уктур ным пер естр ойкам в мембр анах. В таблице показаны структур ные пер еходы, а также энер гии активации соответствующих структур ных со стояний. Как видно из таблицы, для контр ольной группы хар ак-терны два структурных перехода в температурных интервалах 16-20°С и 32-38°С для обеих областей мембр ан, котор ые со хр анялись пр и введении N7-150
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.