ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 578-583
УДК 582.28.05;577.114
ДЕЙСТВИЕ ОКСИГЕНИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИНОЛЕВОЙ И ЛИНОЛЕНОВОЙ КИСЛОТ НА ОБРАЗОВАНИЕ КОНИДИЙ И ПРОТОПЕРИТЕЦИЕВ У ДИКОГО ТИПА И МУТАНТОВ ПО ФОТОРЕЦЕПТОРНОМУ КОМПЛЕКСУ Neurospora crassa
© 2015 г. С. Ю. Филиппович*, Г. П. Бачурина*, Н. Н. Гесслер*, А. Б. Голованов**, А. М. Макарова**, Н. В. Гроза**, Т. А. Белозерская*, ***
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 **Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Москва, 119571 ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
e-mail: tabinbi@mail.ru Поступила в редакцию 12.05.2015 г.
Исследовано регуляторное действие двух оксипроизводных ненасыщенных жирных кислот (оксилипи-нов) — 18-гидрокси-(9Д12.2)-октадекадиеновой кислоты (18-HODE) и 18-гидрокси-(92,12^,152)-окта-декатриеновой кислоты (18-HOTTE), на половое и бесполое размножение штаммов Neurospora crassa дикого типа и мутантов wc-1 и wc-2. Показано, что у штамма дикого типа 18-HODE, в отличие от 18-HOTrE, является стимулятором образования протоперитециев в темноте и на свету. У этого же штамма исследованные оксилипины оказывали влияние на конидиогенез только в условиях освещения: 18-HODE стимулировала, а 18-HOTrE ингибировала образование конидий. Оксилипины не влияли на образование протоперитециев у мутантов по фоторецепторному комплексу, что, по-видимому, свидетельствовало о его участии в передаче сигнала у N. crassa. Стимуляция образования конидий у wc-1 под влиянием исследованных оксилипинов и отсутствие их действия на wc-2 может указывать на наличие альтернативных путей передачи сигнала оксилипинов при конидиогенезе.
Ключевые слова: жирные кислоты, оксилипины, Neurospora crassa, мутанты по фоторецепторному комплексу, конидии, протоперитеции.
БО1: 10.7868/80555109915060057
У всех живых организмов оксигенированные производные жирных кислот, оксилипины, принимают участие в процессах развития и ответах на внешние воздействия. У грибов оксилипины принимают участие в регуляции баланса полового и бесполого воспроизведения, межклеточных взаимодействиях, биосинтезе вторичных метаболитов, диморфизме, а также взаимоотношениях паразит-хозяин у патогенных видов [1]. Несмотря на то, что присутствие оксилипинов у грибов было обнаружено почти 30 лет назад [2—4], их физиологические функции, так же как и пути биосинтеза, до сих пор до конца не ясны, за исключением нескольких видов Aspergillus spp.[5].
Известно, что многие грибы являются возбудителями заболеваний растений, а также вызывают порчу сельскохозяйственной продукции. Кроме того, грибы могут вызывать тяжелые заболевания животных и человека, поэтому понимание механизмов регуляции воспроизведения грибов необходимо для поиска эффективных противогрибковых средств. Значительный интерес представляет регуляция способов размножения у гри-
бов с помощью оксилипинов, так называемая ауторегуляция развития, обычно происходящая под влиянием определенных внешних воздействий [6]. Удобным объектом для такого рода исследований является гриб-аскомицет Neurospora сгазза. Развитие гриба может происходить по половому и бесполому путям воспроизведения, причем переключения с одного пути на другой можно достичь изменением состава среды культивирования. Так, голодание по источнику азота на агаризованной среде приводит к формированию предшественников женских плодовых тел, протоперитециев, а голодание по источнику углерода в тех же условиях — к образованию вегетативных спор, конидий. Кроме того, свет сине-фиолетовой области спектра стимулирует процессы дифференцировки гриба как в сторону формирования конидий (при культивировании на средах, содержащих N^N03 или №N03, но не N^0 [7]), так и протоперитециев [8].
Выбранный объект также удобен для исследования передачи светового сигнала, поскольку в
клетках N. crassa функционирует гетеродимер-ный фоторецепторный комплекс WCC (white collar complex). В его состав входят два мультидомен-ных белка WC-1 и WC-2 — продукты генов white collar-1 (wc-1) и white collar-2 (wc-2). Мутанты по этим генам не реагируют на свет и, в отличие от дикого типа N. crassa, у них не происходит изменения электрических параметров клеточных мембран, биосинтеза каротиноидных пигментов, сдвига фазы циркадного спороношения, образования репродуктивных структур (конидий и про-топеритециев), а также не наблюдается фототропизма клювиков протоперитециев при освещении [8]. Образование WCC происходит при взаимодействии PAS-доменов, входящих в состав полипептидов WC-1 и WC-2. Свет воспринимается молекулой ФАД, нековалентно связанной с LOV-доменом (разновидностью PAS-домена) в апобелке WC-1. Химическая активность возбужденного ФАД служит источником фотоинформационного сигнала в клетке. Присутствие в белках WC-1 и WC-2 "цинковых пальцев", т.е. мотивов узнавания GATA-последовательностей в составе промотора, дает основание рассматривать их как вероятные факторы транскрипции [8]. Таким образом, WC-комплекс N. crassa является одновременно фоторецептором и фактором транскрипции. В настоящее время неизвестно, каким образом осуществляется регуляция процессов воспроизведения с участием оксилипинов. В то же время, WCC является основным регулятором процессов воспроизведения у N. crassa. В предыдущей работе [9] было показано, что оксилипи-ны 3(Д)-гидрокси-(5Д8^,11Д14^-эйкозатетра-еновая кислота (3-HETE) и 18-гидрокси-(9Д12^)-октадекадиеновая кислота (18-HODE) влияли на рост и агрегацию гиф, а также на ряд светозависимых процессов — половое и бесполое воспроизведение у N. crassa. Однако в настоящее время остается неясным, опосредует ли WCC передачу сигнала оксилипинов у N. crassa.
Цель работы — исследование регуляторной роли двух оксилипинов — 18-HODE, производного ли-нолевой кислоты, и 18-гидрокси-(9Z,12Z,15Z)-ок-тадекатриеновой кислоты (18-HOTrE), производного а-линоленовой кислоты, на половое и бесполое размножение дикого типа N. crassa и мутантов по фоторецепторному комплексу.
МЕТОДИКА
Синтез 18-HODE и 18-HOTrE. Оксилипины природной структуры получали по разработанным ранее методикам на основе ацетиленовой стратегии синтеза [10, 11]. Структура синтезированных соединений представлена на рис. 1 и подтверждена данными ЯМР- и масс-спектрометрии.
Объект исследования, получение посевного материала. Работа проводилась со штаммами гриба
(a)
(б)
OH
COOH
COOH
Рис. 1. Структурные формулы оксилипинов 18-HODE (а) и 18-HOTrE (б).
N. crassa: дикий тип 987, мутанты по фоторецеп-торному комплексу wc-1 143 и wc-2 4408 (любезно предоставлены Fungal Genetics Stock Center (FGSC, Kansas City, США).
Подготовку посевного материала для получения конидий и протоперитециев проводили согласно предыдущей работе [9].
Бесполое размножение. На поверхность бислоя целлофан—бумажного фильтра, покрывающего агаризованную среду Фогеля [12] и смоченного жидкой средой того же состава, наносили 0.4 мл водной суспензии конидий, содержащей 1 мг спор. Через 24 ч выращивания мицелия (начало стационарной фазы, воздушные гифы отсутствуют) при 28°С в темноте, под бислой помещали 1 мл водно-этанольной эмульсии с разной концентрацией оксилипинов 18-HODE и 18-HOTrE (5, 10 или 20 мкМ) при красном свете слабой интенсивности. Культуру с добавленным оксилипинами инкубировали в темноте при 28°С в течение 1 ч, а затем освещали в течение 2 ч лампой LDC-36W (Россия) c интенсивностью 15 Вт/м2. Контрольные чашки выдерживали в темноте при той же температуре, что и освещенные. После освещения чашки инкубировали при 28°С в течение 24 ч. Образовавшиеся конидии смывали водой (5 мл на чашку), их количество оценивали с помощью камеры Горяева.
Половое размножение. Половое размножение оценивали по количеству протоперитециев, образовавшихся в темноте или после экспозиции мицелия N. crassa на свету [9]. Стимуляция образования протоперитециев достигалась переносом выращенного на целлофановом диске мицелия на среде с 4 мМ NH4Cl в качестве источника азота, 1% сорбозы и 0.1% глюкозы в качестве источников углерода на ту же среду, но без источника азота. После 24 ч инкубации при 23°С под целлофановый диск вносили исследуемые оксилипины и культуры инкубировали в темноте 1 ч, а затем освещали в течение 2 мин (350—500 нм; 1 Вт/м2). Подсчет образовавшихся протоперитециев проводили через 2 сут инкубации в темноте при 23°C.
0 5 10 20 50 0 5 10 20 50
мкМ мкМ
Рис. 2. Действие 18-HODE (а) и 18-HOTrE (б) на половой цикл штамма N. crassa дикого типа: 1 — темнота; 2 — свет.
При постановке экспериментов использовали от 3 до 9 биологических повторностей. Статистическую обработку проводили с помощью пакета MS Excel 2000.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Действие 18-HODE и 18-HOTVE на половое размножение штамма N. crassa дикого типа и мутантов по фоторецепторному комплексу. На рис. 2
представлено действие испытуемых оксилипинов на образование протоперитециев в темноте и под действием света. Добавление 18-HODE в диапазоне концентраций от 5 до 50 мкМ (рис. 2а) стимулировало этот процесс в темноте, максимальное действие отмечено при концентрации 10 мкМ. Сходный ответ был получен на освещенных культурах N. crassa, обработанных данным соединением, причем максимальный эффект наблюдали при концентрации 5 мкМ. Повышение концентрации 18-HODE (до 10—50 мкМ) несколько снижало действие света на образование предшественников половых структур. При концентрации 5 мкМ наблюдалось суммированное действие двух факторов — оксилипина и света.
Действие 18-HOTrE (рис. 2б) в пределах исследуемых концентраций в темноте почти не отличалось от контроля, а на свету приводило к незначительному ингибированию процесса во всем диапазоне исследуемых концентраций.
Таким образом, в отличие от 18-HODE, производного линолевой кислоты, действие производного линоленовой кислоты, 18-HOTrE, на формирование протоперитециев у N. crassa значительно слабее.
Результаты сравнительного исследования действия оксилипинов 18-HODE или 18-HOTrE (5 мкМ) на половой процесс у штаммов N. crassa дикого типа и мутантов по фоторецепторному
комплекс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.