научная статья по теме ДЕЙСТВИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ СВЕТЯЩИХСЯ ГРИБОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ДЕЙСТВИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ СВЕТЯЩИХСЯ ГРИБОВ»

УДК 577.3;582.284

ДЕЙСТВИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ СВЕТЯЩИХСЯ ГРИБОВ

© 2011 г. Г. А. Выдрякова, А. А. Гусев, С. Е. Медведева

Институт биофизики СО РАН, Красноярск, 660036 e-mail: vydryakova@mail.ru Поступила в редакцию 17.11.2009 г.

Оценена возможность создания твердофазного биолюминесцентного биотеста с использованием светящегося воздушного мицелия грибов. Исследовано действие органических и неорганических токсических веществ (ТВ) в концентрациях от 10-6 до 1 мг/мл на свечение воздушного мицелия культур 4 видов светящихся грибов: Armillaria borealis (Коллекция культур ИЛ СО РАН), A. mellea, A. gallica и Lampteromy-ces japonicus (Коллекция грибов БИН РАН). Наиболее чувствительной к действию растворов модельных ТВ оказалась культура A. mellea. Показано, что чувствительность светящихся грибов сравнима с таковой светящихся бактерий, используемых для мониторинга окружающей среды. Использование в качестве тест-объекта светящегося воздушного грибного мицелия на твердофазном носителе является перспективным направлением биотестирования для создания биосенсоров с целью непрерывного мониторинга воздушной среды.

Биолюминесцентный анализ — один из возможных экспресс-методов мониторинга окружающей среды, обнаружения токсических веществ (ТВ) как органических, так и неорганических, включая тяжелые металлы. Наибольшее применение в биолюминесцентном анализе нашли светящиеся бактерии. Ингибирование свечения бактерий ТВ служит основой большинства биолюминесцентных биотестов, среди которых наиболее популярными являются лиофилизированные светящиеся бактерии в качестве тест-объектов благодаря их высокой чувствительности к микроколичествам токсических веществ и простоте использования [1—5]. Большое распространение в биолюминесцентном анализе получили генетически модифицированные бактерии, несущие /их-гены светящихся бактерий и других светящихся организмов [5—7]. Однако с помощью бактериальных биотестов не всегда можно оценить воздействие веществ на эукариотические организмы и обнаружить ТВ в воздушной среде. Разработка и использование биотестов более высоко организованных организмов (дрожжи, черви, грибы), несущих гены люминесцентной системы, открывает новые перспективы развития биолюминесцентного анализа.

В последние годы наблюдается увеличение количества исследований, посвященных изучению светящихся грибов благодаря возможности их использования в биолюминесцентном анализе. Количество известных светящихся грибов [8—10] неуклонно растет в связи с обнаружением новых видов [11, 12]. К настоящему времени насчитывается

83 вида светящихся грибов [13], в то время как среди бактерий известно лишь 17 [14]. Светящиеся грибы всех известных видов испускают голубовато-зеленый свет с максимумом около 530 нм [15]. Грибы в зависимости от видовой принадлежности светятся в широком диапазоне температур: от 4 до 50°С [16]. На агаризованных средах и на древесине свечение мицелия может длиться от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от вида гриба.

Длительное свечение грибов в широком температурном диапазоне, наличие воздушного мицелия делают перспективным создание на их основе новых биолюминесцентных биотестов непрерывного действия, которые могут быть использованы для обнаружения токсичности, в том числе и в воздушной среде.

Цель работы — сравнение действия токсических веществ (ТВ) органической и неорганической природы на уровень свечения воздушного мицелия культур АгтШапа ЬогеаШ, А те//еа, А ^^а//1са и Ьатр1еготусез ,]аротсш.

МЕТОДИКА

Объектами исследования были культуры грибов, имеющие светящийся мицелий: АгтШапа те//еа, А^аШса и Ьатр1еготусез ]аротсш из Коллекции культур базидиомицетов ЛЕ(БИН) Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН и А ЪогеаШ из рабочей коллекции культур Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (табл. 1).

Таблица 1. Культуры грибов, использованные в экспериментах

Культура Штамм, № в коллекции Место и год выделения Коллекция грибов

Armillaria gallica (Vahl.) P. Kumm. 1043 Центральный Урал, Пермская обл., 1993 ЛЕ(БИН)

A. mellea (Vahl.) P. Kumm., s.l. 0356 Минская область, Беларусь, 1970 »

Lampteromyces japonicus (Kawam.) Singer 491 Великобритания, 1947 »

A. borealis (Marxm. & Korhonen) 3к-4 Красноярский край, 2007 Рабочая коллекция ИЛ СО РАН

Таблица 2. Величина остаточной люминесценции (%) по истечении 3 мин после добавления токсичного вещества

Вещество Концентрация, мг/мл

1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Бензохинон 27 35 42 63 65 74 79

CuSO4 33 52 58 88 67 81 85

В качестве модельных ТВ использовали водные растворы солей, в том числе тяжелых металлов: Na2WO4, NiSO4, CoCl2, (NH4)2MoO4, CrSO4, ZnSO4, Li2SO4, AlCl3, MnCl2, CsCl, CdSO4, SnCl2, HgCl2, ацетата свинца [РЬ(ОСОСН3)2], а также бензохи-нона (БХ), фенантренхинона (ФАХ), 5-амино-2-3 дигидро-1,4-фталазиндиона (A-ДХ-ФД) и 1,2-нафтохинон-4-сульфоновой кислоты (НХ-СК) в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, и 1 мг/мл. Токсичность исследуемых растворов оценивали по величине биолюминесцентного индекса (БИ), который рассчитывали по формуле: БИ = Io/Ik, где Io — нормированное относительно исходного значение интенсивности свечения грибного мицелия в опыте, Ik — нормированное относительно исходного значение интенсивности люминесценции грибного мицелия в контроле.

Культуры выращивали на агаризованной среде Сабуро (40 г глюкозы, 10 г пептона, 15 г агар-агара на 1 л дистиллированной воды) при комнатной температуре. Эксперименты по действию ТВ проводили при наличии видимого свечения мицелия. Интенсивность свечения измеряли на планшетном люминометре Luminoscan Ascent ("ThermoElectron Co", Финляндия). Блоки агаризованной среды площадью около 3 х 3 мм2 с растущей светящейся культурой грибов помещали в лунки планшета (куда

предварительно для предотвращения высыхания агара вносили 50 мкл стерильной дистиллированной воды) и измеряли исходную интенсивность люминесценции. После добавления 200 мкл исследуемого вещества в лунки с культурой повторно измеряли люминесценцию через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В контрольные варианты вносили 200 мкл дистиллированной воды. Нормированные значения рассчитывали по отношению к исходному свечению. Растворы исследуемых веществ считали токсичными, если отклонение величины биолюминесцентного индекса опыта от 1 (биолюминесцентный индекс контроля) превышало 20%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Предварительно нами был проведен эксперимент по кратковременному воздействию (3 мин) растворов Си804 и бензохинона в концентрациях 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 и 1 мг/мл на свечение мицелия А. швИва (табл. 2). Минимальная концентрация бензохинона (10-6 мг/мл) вызывала уменьшение уровня свечения на 21% по сравнению с начальным, в то время как 3 мин воздействие бензохи-нона в концентрации 1 мг/мл вызвало падение уровня люминесценции на 73%. Воздействие раствора Си804 в концентрации 10-6 мг/мл приводило

(а)

БИ

6

5 4

3 2

0

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI хмвшп

БИ (б)

7

с 1 ■2

3

п4 •5

■ 6

а

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVIIXVШ

Рис. 1. Действие модельных ТВ в течение 5 (а) и 30 мин (б) на свечение воздушного мицелия (БИ) АгшШапа ЬогваШ. (На рис. 1, 2 приводятся нормированные значения свечения. БИ = 1 — биолюминесцентный индекс контроля. Область, ограниченная пунктирными линиями БИ = 0.8—1.2, обозначает зону нетоксичного действия вещества). I - №^04; II - №804; III - СоС12; IV - (№Н4)2Мо04; V- Сгё04; VI - ацетат свинца, VII - 2и804; VIII -Li2S04; IX - А1С13; X - МпС12; XI - С8С1; XII - Са804 ■ ■ 8Н20; XIII - SnC12; XIV - ЩС12; XV - бензохинон, XVI - фенантренхинон; XVII - амино-2-3 дигидро-1,4-фталазиндион; и XVIII - 1,2-нафтохинон-4-суль-фоновой кислоты.

Концентрация ТВ (мг/мл): 1 4 - 10-3; 5 - 10-4; 6 - 10-5.

1; 2

10-1; 3

10-

к уменьшению люминесценции на 15%, а в концентрации 1 мг/мл к ее падению на 67% по сравнению с исходным значением.

В последующих экспериментах нами было исследовано действие ряда органических и неорганических веществ в концентрациях от 10-5 до 1 мг/мл на свечение исследуемых культур светящихся грибов (рис. 1, 2). В ходе экспериментов было показано, что для определения возможного токсического действия растворов модельных ТВ на свечение грибного мицелия достаточно 5 мин экспозиции. Так, на рис. 1а и 1б приведены данные по определению биолюминесцентного индекса культуры А. Ьо-

БИ

32 28 24 20 16 12 8 4 0

(а)

о 1 ш2

■ ■■3 ..4

■ 5

об

гтттгогга

II III IV V VI VIIVIII IX X XI XIIXIIIXIV XV XVIXVIIXVIII (б)

а1 ш2

■ ■■3 ..4

■ 5

об

I

II III IV V VI VII VIII IX X XI

(в)

о 1 ш2

■ ■3 ..4

■ 5

аб

БИ

6 5 4 3 2 1 0

БИ

3.0

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

I II III IV V VI VIIVIII IX X XI XIIXIIIXIVXVXVIXVIKVIII

Рис. 2. Действие модельных ТВ (5 мин) на свечение воздушного мицелия (БИ) АгшШапа шв11ва (а), Ьашр1вгошуовз ]аротош (б), А. gaШca (в). Обозначения ТВ и их концентрации аналогичны приведенным на рис. 1.

гваШ при воздействии на нее тестируемых растворов в течение 5 (рис. 1а) и 30 (рис. 1б) мин. Как следует из приведенных на рисунках данных, действие наиболее эффективных токсикантов проявляется уже после 5 мин экспозиции, поэтому в дальнейшем мы не приводим данные, полученные для 10, 15, 20, 25 и 30 мин воздействия исследуемых растворов на культуры светящихся грибов.

Эффект используемых модельных ТВ на люминесценцию грибного мицелия был разнонаправлен и зависел от концентрации тестируемого вещества и видовой принадлежности гриба (рис. 1, 2).

Культура А. Ьогва& оказалась чувствительной к действию ионов металлов Мп, С8, РЬ, Сё и А1. Большинство исследованных растворов солей этих металлов разных концентраций стимулировало свечение мицелия данной культуры, а растворы солей

1

1

0

Со, Сг и ацетата свинца в низких концентрациях его ингибировали. Действие растворов органических веществ не было столь выраженным (рис. 1а, 1б).

В случае культуры А швИва наибольший эффект (увеличение уровня свечения в 5 и более раз) наблюдался при действии солей Сё, Zn, Li, А1, Мп, Щ. Таким же явно выражен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком