= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК: 577.15 + 577.352 + 577.354.9
ДЕЙСТВИЕ РАЗБАВЛЕННЫХ РАСТВОРОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ
© 2014 г. Н.П. Пальмина, Е.Л. Мальцева, Т.Е. Чаеовекая
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: пра1т@$ку.скрк.та$.ги Поступила в p едакцию 10.02.14 г.
После доработки 03.04.14 г.
Приводятся данные об изменении физико-химических свойств биологических мембран различного происхождения (плазматических, микросомальных, синаптосом) под действием биологически активных веществ, отличающихся по своему химическому строению и механизму действия (природного и синтетического антиоксидантов, тиротропин-рилизинг-гормона, фор-боловых эфиров) в широком интервале концентраций (10-22—10—3 М). Полученные дозовые зависимости эффекта биологически активных веществ на активность мебраносвязанных ферментов, пероксидное окисление липидов, структурное состояние различных липидных регионов липидного бислоя мембран проанализированы с точки зрения их формальной общности: наличия полимодальности, количества и положения максимумов, возможной смены знака эффекта. Сделана попытка объяснения механизма возникновения каждого из наблюдаемых максимумов на этих кривых. Максимум в интервале относительно высоких, «физиологических» концентраций (10—3—10—6 М) связан с встраиванием биологически активных веществ в биомембраны. Максимумы в интервале сверхмалых доз (10—11—10—16 М) и «мнимых» концентраций (10-18 M), когда присутствие молекулы биологически активного вещества в реакционном объеме носит вероятностный характер, авторы объясняют физико-химическими свойствми разбавленных растворов этих веществ. Это заключение сделано на основании собственных данных об изменении ИК-спектров водных растворов биологически активных веществ и результатов, полученных академиком А.И. Коноваловым с сотрудниками, о физико-химических свойствах разбавленных растворов биологически активных веществ (удельной электропроводности, поверхностного натяжения, заряда), обусловленных образованием так называемых «наноассоциатов» из молекулы биологически активного вещества и большого количества молекул воды. И образование «наноассоциатов», и биологический эффект в интервале сверхмалых доз исчезают при изоляции растворов биологически активных веществ от магнитного поля Земли. Таким образом, именно «наноассоциаты» являются материальными носителями эффекта сверхмалых доз.
Ключевые слова: клеточные мембраны, биологически активные вещества, разбавленные растворы, наноассоциат ы.
Одним из важных и во многом загадочных открытий последних десятилетий является об-нар ужение влияния растворов биологически активных веществ (БАВ) в низких (включая пи-комоляр ные) и сверхнизких (фемтомоляр ные и ниже) концентрациях на биологические пр оцес-сы. Эффекты сверхмалых доз (СМД) были зарегистрированы в экспериментах с веществами различной химической природы и биологиче-
Сокращения: БАВ - биологически активные вещества, СМД - сверхмалые дозы, ПОЛ - перекисное окисление липидов, а-ТФ - а-токоферол, ФК - фенозан калия, ТРГ -тиротропинин-рилизинг-гормон, ПК-С - протеинкина-за С, ДК - диеновые конъюгаты, МДА - малоновый диальдегид, ТФА - 12-0-тетродеканоил-форбол-13-ацетат, ДДФ - 4-а-форбол-12,13-дидеканоат, ЭР - эндоплазмати-ческий ретикулим, ПМ - плазматическая мембрана.
ского действия: гормонами, антиоксидантами, противоопухолевыми агентами, иммуномодуля-торами и др. [1-7] на системах с различным уровнем биологической организации - от макромолекул и клеточных структур, до целых организмов и популяций. Однако, несмотря на большой объем накопленных за десятилетия экспериментальных данных, до сих пор не создано единой теории, способной объяснить подобные явления. Анализ полученных р езульта -тов позволил выявить ряд общих закономерностей, характерных для всех БАВ, проявляющих активность в сверхмалых дозах на разно-образных биологических системах [2-4]: 1) немонотонную, нелинейную полимодальную зависимость «доза-эффект» с несколькими максимумами, разделенными между собой так на-
зываемой «мертвой зоной», где эффект не про -является; 2) изменение чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообр азных агентов в СМД; 4) зависимость «знака» эффекта от начальных характеристик объекта; 5) «расслоение» свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при которой еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты. Наиболее важной и общей из этих закономер ностей, которая соблюдается для всех исследованных БАВ, является нелинейная зависимость эффекта от концентрации агента [2-4].
Данное явление настолько необычно и необъяснимо с позиций классических научных представлений, что в течение первых десятилетий после его открытия усилия ученых были направлены в основном на доказательство р е-альности его существования [1-7]. В большинстве случаев под механизмами действия БАВ подразумевали те биохимические или биофизические последствия, которые происходили в том или ином объекте исследования после воздействия агента в СМД [2-4,8].
Мы использовали в качестве объекта исследования различные биологические мембраны и проводили эксперименты in vitro. Этот выбор обусловлен тем, что: 1) ряд авторов рассматривает именно биологические мембраны в качестве мишени действия БАВ в сверхмалых дозах [2,9-11]; 2) в биологических мембранах клеток сосредоточены важнейшие регуляторные системы, отвечающие за их функционирование: системы вторичных поср едников (циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла), обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку [12-14], и система регуляции пероксидного окисления ли-пидов (ПОЛ), влияющая на со стояние липид-ного бислоя [15,16]. В силу своей общей локализации данные регулято рные системы влияют друг на друга [13,14,17,18], поэтому вещества, модифицир ующие состояние одной из них, могут индуцировать изменения и в других системах регуляции.
Выбор объекта исследования определил и те БАВ, влияние которых на мембраны мы исследовали в широком интервале концентраций: 1) природный а-токоферол (а-ТФ) и его синтетический аналог (калиевая соль в-(4-гид-рокси-3,5-дитретбутил-фенил) пропионовой кислоты - фенозан калия (ФК) - антиоксид анты, модификаторы системы ПОЛ; 2) тиротропин-рилизинг-гор мон (ТРГ), который, взаимодействуя с р ецептор ом на плазматической мембране, оказывает влияние на аденилатциклазную регулятор ную систему; 3) форболовые эфиры, спе-
цифические активаторы фосфоинозитидного цикла, у которых в качестве рецепто ра выступает мембраносвязанный фермент протеинки-наза С (ПК-С).
Были изучены следующие характеристики биомембран: активность мембраносвязанного фермента протеинкиназы С [19]; образование продуктов ПОЛ и расход липидного субстр ата при инициированном и спонтанном ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума [11]; изменение структур ы различных липидных областей плазматических и микросомальных мембран [21,22]. Активность ПК-С определяли радиоизотопным методом [18,22]. ПОЛ характеризовали спектр офотометрически по обр азо-ванию диеновых конъюгатов и кетодиенов [23]. Оценку суммарной ненасыщенности проводили методом озонирования [24]. Структур ные изменения в поверхностных и глубоко лежащих слоях липидов оценивали методом ЭПР с использованием в качестве зондов стабильных свободных радикалов - 5- и 16-доксилстеари-новых кислот (С5 и С16) [25,26], 4-каприлок-сил - ТЕМПО; 4-пальмитоилоксил-ТЕМПО; 5,6-бензо-2,2,4,4-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксила [25,26]. За длительный период работы с указанными веществами и различными мембранами нами получен большой комплекс зависимостей перечисленных свойств от концентрации БАВ.
ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
На рис. 1 приведены дозовые зависимости изменения активности ПК-С под действием природного (а-ТФ) и синтетического (ФК) анти-оксидантов в интервале концентраций (10-1810-2 М), полученные нами в работах [18,19]. Видно, что оба антиоксиданта оказывают существенный эффект на активность данного ре-гуляторного фермента, обе кривые имеют нелинейный бимодальный характер, с максимумами в различных интервалах концентраций: 10-4 М и 10-12-10-14 М для а-ТФ и 10-18 М и 10-6 М - для ФК, между которыми находится так называемая «молчащая» или «мертвая зона», когда эффект либо значительно снижается, как в случае с а-ТФ, или исчезает совсем, как в случае ФК. Интересно отметить, что при этом а-ТФ является ингибитором ПК-С, а ФК -суперактиватором; количественный эффект для С МД достигает 60% для а-ТФ и 400% для ФК. Таким образом, концентрационные зависимости действия антиоксидантов на данный фермент полностью соответствуют основному признаку для эффекта БАВ в С МД - наличию
Рис. 1. Концентрационные зависимости изменения активности пр отеинкиназы С под действием а-ТФ. (а) - Ингибирование в процентах по отношению к контр олю; под действием ФК (б) - активация в пр оцентах по отношению к контр олю.
нелинейной зависимости. Ср авнение эффективности ингибир ования активности ПК-С пр и высоких и ультр анизких концентр ациях а-ТФ на о сновании изучения кинетических пар аметр ов фермента в присутствии 10-4 и 10-14 М а-ТФ соответственно показало, что а-ТФ в высоких концентр ациях действует как ингибито р смешанного типа, а в ультр анизких - как «алло-стерический» эффектор [27]. а-ТФ в качестве р егулято р а более эффективен в СМД благодар я наличию положительной кинетической коопе-ративности с коэффициентом Хилла, близким к 2, и в два раза большему сродству ПК-С к гистону Н1. Иными словами, сверхмалая доза а-ТФ приводит к увеличению чувствительности фер мента к суб стр ату по ср авнению с концентр ацией 10-4 М. Ра ссчитанное нами соотношение компонентов реакции фосфорилирования показало, что в случае сверхнизкой концентр а -
ции а-ТФ одна его молекула воздействует на 2500 молекул ПК-С [18].
Аналогичные би- или полимодальные до -зовые зависимости были получены при воздействии БАВ и на другие мембраносвязанные фер менты: аденилатциклазу [28]; глутатионпе-роксидазу и глутадионредуктазу митохондрий [
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.