БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 3, с. 169-176
УДК 577.125.53
ДЕЙСТВИЕ САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОЛИПАЗЫ D И УРОВЕНЬ АКТИВНЫХ ФОРМ
КИСЛОРОДА В ПРОРОСТКАХ СОИ
© 2012 г. Т. А. Калачёва*, О. Н. Яковенко, С. В. Кретинин, В. С. Кравец
Институт биоорганической химии и нефтехимии НАНУкраины, Мурманская 1, Киев 02094, Украина; *электронная почта: kalachova@bpci.kiev.ua; t.a.kalachova@gmail.com Поступила в редакцию 18.06.2011 г. После доработки 11.11.2011 г.
Сигнальные пути фитогормонов — медиаторов биотического стресса — салициловой и жасмоновой кислот и их внутриклеточное действие реализуются при участии регуляторных элементов липидной природы. Установлено, что салициловая кислота активирует фосфолипазу Б, которая обеспечивает продукцию вторичного мессенджера — фосфатидной кислоты. Под воздействием медиаторов защитных реакций изменяется также баланс активных форм кислорода, что проявляется накоплением эндогенного пероксида, а также снижением активности каталазы и повышением активности пе-роксидаз и супероксиддисмутазы. Полученные результаты свидетельствуют о взаимодействии фос-фолипазы Б и антиоксидантных систем клетки при формировании первичных адаптивных реакций растений на действие медиаторов биотического стресса.
Ключевые слова: фосфолипазы, внутриклеточная сигнализация, активные формы кислорода, салициловая кислота, стресс.
Устойчивость растений к воздействию патогенов обеспечивается разветвленной сетью защитных механизмов. В зависимости от стратегии питания и репродукции инфицирующего агента в растениях индуцируются разные защитные механизмы. Так, при заражении патогенами с некро-трофным типом питания (бактерии, грибы) запускается сигнальный путь жасмоновой кислоты и этилена, в то время как опосредованные салициловой кислотой механизмы обеспечивают устойчивость к биотрофным патогенам, в частности к вирусам [1] (рис. 1). Особый интерес вызывают сигнальные каскады, вовлеченные в регуляцию метаболического ответа растений на действие салициловой и жасмоновой кислот — фитогормонов, ассоциированных с реакциями растений на биотический стресс и выступающих модуляторами системной приобретенной устойчивости. Получены данные, указывающие на антагонистический характер взаимодействия сигнальных путей салициловой и жасмоновой кислот [2], в то время как при низких концентрациях экзогенных фитогормонов наблюдался синерги-ческий эффект [3], что может иметь важное значение для быстрой активации защитных систем растения на ранних этапах воздействия биотического стрессового фактора независимо от его природы [4].
В настоящее время известно, что в регуляции метаболизма клеток растений, на которые воздействовали фитогормоны — медиаторы биотического стресса, участвуют ферменты липидного обмена. При инфицировании патогенами и обработке синтетическими или природными индукторами устойчивости активируются диацилглице-ролкиназы, фосфорилирующие продукт фосфолипазы С до фосфатидной кислоты [5]. Показано, что активация салициловой кислотой фосфолипаз С и D в суспензионной культуре и in vitro приводила к накоплению фосфатидной кислоты — вторичного посредника липидной природы, вовлеченного в процессы внутриклеточной передачи сигнала, в частности, ассоциированные с адаптивными реакциями [6].
Регуляторная роль фосфатидной кислоты (рис. 1) реализуется путем непосредственного взаимодействия с ферментами и модификации их активности [7]. Одна из мишеней фосфатидной кислоты — ферменты, участвующие в генерации активных форм кислорода (АФК) — NADPH-ок-сидазы [8]. Известно, что АФК являются вторичными посредниками с широким спектром действия. Они регулируют такие важные процессы, как экспрессия генов, связанных с ростом и развитием, клеточный цикл, ответ на абиотические
Клеточная стенка
CK ЖК
Формирование адаптивных реакций
Рис. 1. Схема элементов сигнальных каскадов салициловой и жасмоновой кислот в растительных клетках.
стрессы, развитие реакции гиперчувствительности на заражение патогенами, апоптоз [9]. Среди мишеней АФК в мембранных структурах клетки особое место занимают полиненасыщенные жирные кислоты, перекисное окисление которых считается важным показателем адаптированно-сти метаболизма. В то же время изменение уровня эндогенных АФК приводит к активации ферментов антиоксидантных систем (супероксиддисму-таза, каталаза, гваяколпероксидаза, дегидроас-корбатредуктаза, глутатионпероксидаза, глутати-онтрансфераза). Таким образом, изменение баланса внутриклеточных АФК может рассматриваться в качестве тонкого регулятора метаболизма, обеспечивающего как быстрые сигнальные реакции, так и отсроченный адаптационный ответ [8]. На сегодня известно, что салициловая кислота вовлечена в регуляцию ряда метаболических процессов и физиологических реакций растений [10]. Однако ранние этапы сигнальных каскадов этого фитогормона и участие в них мембранных компонентов остаются недостаточно изученными (рис. 1). Целью данной работы было изучение роли фосфолипазы Э и АФК как вторичных посредников сигнальных каскадов в реакции растений на воздействие салициловой и жасмоновой кислот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали этиолированные проростки сои Glycine max (сорт Ворскла, полученный в Национальном научном центре "Институт земледелия Украинской академии аграрных наук").
Активность фосфолипазы D в тканях проростков сои, обработанных салициловой кислотой, определяли по реакции трансфосфатидилирова-ния меченных 33Р фосфолипидов в присутствии 1-бутанола в среде инкубации. Образец ткани (200 мг) в 25 мМ Mes-KOH-буфере (pH 6.4) инкубировали с 3.7 Бк 33Р-ортофосфата в течение 14 ч при 25°С. Для определения активности фосфолипазы D в среду инкубации добавляли 0.8% 1-бута-нол и выдерживали в течение 1 ч перед внесением салициловой кислоты. Фосфолипиды экстрагировали 3.75 мл смеси хлороформ/метанол/соляная кислота (50 : 100 : 1, v/v/v), экстракты выпаривали током азота и хранили при —20°С. Фосфолипиды разделяли при помощи тонкослойной хроматографии в системе этилацетат/аммиак/во-да. Интенсивность образования фосфатидилбу-танола определяли методами радиоавтографии и сцинтилляционного счета [11].
Содержание эндогенного пероксида водорода определяли в реакции окисления с ксиленоловым оранжевым [12]. Ферменты экстрагировали 0.2 М
действие салициловои и жасмоновои кислот
171
Фосфатидилбутанол
j Фосфатидная кислота
У Структурные фосфолипиды
а
1
12 3
Рис. 2. Активация фосфолипазы D в проростках сои под воздействием салициловой кислоты: а — радиоавтограф, б — сцинтилляционный счет радиоактивности фосфатидилбутанола, 33Р, импульс/мин. 1 — Контроль; 2 — салициловая кислота, 1 мМ, 30 мин; 3 — салициловая кислота, 1 мМ, 60 мин.
фосфатным буфером (рН 7.4). Активность ката-лазы измеряли по уменьшению абсорбции при 240 нм в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 20 мМ Н2О2. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ Н2О2 в 1 мин. Активность пероксида-зы измеряли по увеличению абсорбции при 470 нм в 50 мМ фосфатном буфере (рН 5.5), содержащем 1 мМ гваякола и 0.5 мМ Н2О2. За единицу активности принимали количество пероксидазы, вызывающее увеличение абсорбции на 0.01 в 1 мин. Активность супероксиддисмутазы измеряли по подавлению фотохимического окисления нитро-синего тетразолия в реакционной смеси, содержащей 2 мкМ рибофлавина, 13 мМ метионина, 75 мкМ нитросинего тетразолийхлорида, 0.1 мМ ЕБТА, 50 мМ фосфатный буфер (рН 7.8), 50 мМ карбонат натрия и 100 мкл экстракта ферментов. Реакцию инициировали освещением реакционной смеси флуоресцентной лампой (30 Вт) в течение 10 мин. Экстинкцию измеряли при 560 нм против неосвещаемой реакционной смеси [13].
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Действие салициловой кислоты на активность фосфолипазы D. Нами изучено участие фосфолипазы О в формировании первичного метаболического ответа растений сои на салициловую кислоту и в восприятии воздействия данного медиатора стресса. Особенность фосфолипазы О состоит в возможности использования первичных спиртов в качестве альтернативного субстрата в реакции трансфосфатидилирования, что приводит к интенсивному образованию специфичного продукта — фосфатидилбутанола. Вторичные и третичные спирты в данную реакцию не вступают. Важно отметить, что первичные спирты рассматриваются в качестве неспецифичного ингибитора клеточного ответа, в котором участвует фосфолипаза О (рис. 2). Нами показано, что в проростках сои после 30 мин обработки 1 мМ салициловой кислотой уровень фосфатидилбутанола увеличивается
на 50% по отношению к контролю и более чем на 60% — после инкубации в течение 1 ч, что указывает на активацию фосфолипазы D. Накопление фосфатидной кислоты, происходящее параллельно с образованием фосфатидилбутанола после воздействия салициловой кислоты в течение 60 мин, также может свидетельствовать о вовлечении альтернативных путей образования фосфатидной кислоты с участием диацилглицеролкиназ в условиях ингибирования активности фосфолипазы D.
Таким образом, активация сигнального пути фосфолипазы D салициловой кислотой может рассматриваться в качестве одного из ключевых механизмов формирования защитного ответа растений на действие патогенов.
Важно отметить, что среди известных на сегодняшний день компонентов сигнальных каскадов салициловой кислоты выделяют белки с мембранной локализацией и липазной активностью, в частности EDS1, PAD4, EDS4, EDS5 и NDR1 (рис. 1). Трансгенные растенияArabidopsis thaliana, у которых снижена экспрессия генов данных ферментов, характеризовались ослабленной устойчивостью к инфекциям, слабым накоплением фитоалексинов и салициловой кислоты при воздействии патогенов, сниженной экспрессией генов резистентности и неспособностью к формированию системной приобретенной устойчивости [15]. Салицилат-связывающий белок проявляет также липазную и эстеразную активности, а его дефицит влияет как на локальную резистентность (гиперчувствительность), так и на формирование системной приобретенной устойчивости [16]. В суспензионной культуре A. thaliana салициловая кисл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.