МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 2, с. 169-174
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.873.6.017.7
ДЕЙСТВИЕ СВЕТА, ТРАНСФОРМИРОВАННОГО СВЕТОКОРРЕКТИРУЮЩЕЙ ПЛЕНКОЙ, НА ОКСИГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА PSEUDOMONAS
© 2011 г. Д. А. Филатов1, Л. И. Сваровская, В. С. Овсянникова, Л. К. Алтунина
Институт химии нефти СО РАН, Томск Поступила в редакцию 19.01.2010 г.
В лабораторных условиях исследовано влияние света, трансформированного светокорректирующей пленкой, на динамику роста и ферментативную активность микроорганизмов рода Pseudomonas (P. stutzeri и Р. putida) в жидкой среде с 2% нефти. В условиях применения светокорректирующей пленки как укрывного материала численность исследуемых микроорганизмов возрастает на 2—2.5 порядка. При этом активность каталазы и дегидрогеназы увеличивается в 2—2.5 раза, скорость накопления альдегидов как промежуточных продуктов метаболизма при микробном окислении нефтяных углеводородов возрастает в 2.5 раза. По данным ГЖХ и элементного анализа, процессы микробного окисления углеводородов нефти протекают значительно быстрее по сравнению с контрольными вариантами.
Ключевые слова: углеводородокисляющие микроорганизмы, светокорректирующие пленки, дегид-рогеназа, каталаза, красный свет, фотолюминесцентная активация.
Проблема светочувствительности микроорганизмов привлекает все большее внимание исследователей. В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении механизмов ряда фотобиологических процессов [1]. Установлено также, что все растения и водоросли характеризуются наличием специальных фоторегуляторных систем, эффективно контролирующих их рост и развитие [2]. Обнаружение фоторегуляторной системы у широкого круга микроорганизмов позволяет рассматривать ее как древнюю светочувствительную систему регуляции. В литературе недостаточно данных об эффектах и механизмах действия света на метаболизм гетеротрофных микроорганизмов. Исследование регуля-торного действия света на жизнедеятельность микроорганизмов является одной из актуальных проблем современной фотобиологии [3—5].
В последние годы особое внимание привлекают светокорректирующие пленки, которые применяются для повышения урожайности сельскохозяйственных культур [6, 7]. Влияние пленок на развитие растений связывается с изменением количественного и качественного состава проходящего через них электромагнитного излучения солнца, а именно поглощение ультрафиолетовой составляющей и трансформацией ее в красную область спектра [8]. Ранее нами было показано, что прошедший через светокорректирующую пленку солнечный свет и трансформированный фотолюминофорами пленок, стимулирует процессы роста и оксигеназную
1 Автор для корреспонденции (е-шаП: Sli@ipc.tsc.ru).
активность аборигенной почвенной микрофлоры при биодеградации нефти [9, 10].
Механизм стимулирующего влияния преобразованного солнечного света на рост и биохимическую активность микрофлоры до конца неясен. Обнаружено увеличение числа бактериальных клеток, изменение синтеза ДНК, РНК и белка [2].
Аэробные бактерии рода Pseudomonas — важная в научном и практическом отношении группа микроорганизмов, распространенная в биосфере и принимающая активное участие в процессах разложения органических соединений [12]. Это послужило основанием для выбора объектов исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование стимулирующего влияния света, трансформированного светокорректирующей пленкой, на динамику численности и биохимическую активность бактерий Pseudomonas stutzeri и P. putida в процессе окисления нефтепродуктов в жидкой среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования были штаммы Pseudomonas stutzeri и P. putida, выделенные из пластовой воды нефтяного месторождения.
Определение штаммов до вида проводили в Новосибирском ЦКП "Секвенирование". ДНК выделяли при помощи набора "Медиген". Полученные последовательности сравнивали с последовательностями из баз данных nr Database NCBI.
Культуры выращивали в условиях периодического культивирования в жидкой минеральной среде
Раймонда с 2% нефти Лас-Еганского месторождения в качестве единственного источника углерода и энергии.
Эксперимент ставили в трех вариантах:
1. На свету, под светокорректирующей пленкой ФЕ (люминофор — комплекс нитрата европия с фе-нантролином (Eu(NO3)3Phen2), максимум люминесценции 615 нм).
2. На свету, под пленкой ПЭВД (полиэтилен высокого давления).
3. В темноте, под стеклянной крышкой.
Последние два варианта служили контролем.
Источник освещения — совмещенный спектр двух ламп: люминесцентной лампы ЛБ-40 (Россия) и УФ лампы "LH9-UV BLACK LIGHT" ("Nantong Samfier Lighting Electrical Co", КНР). Лампа ЛБ-40 моделирует солнечный спектр в области фотосинте-тически активной радиации ФАР 400—710 нм, интенсивность облучения 29 Вт/м2. УФ лампа моделирует УФ часть солнечного спектра в интервале 320— 400 нм с максимумом 365 нм, мощность 9 Вт, интенсивность облучения 4 Вт/м2. Режим облучения — 6 часов в сутки. Пропускание пленкой ПЭВД излучения в УФ диапазоне (320—400 нм) составляет 65%; в диапазоне ФАР (400—710 нм) — 59%; для пленки ФЕ эти значения составляют 76 и 73% соответственно.
Продолжительность эксперимента — 15 сут при 18—20°С. На протяжении опыта определяли ферментативную активность, численность микроорганизмов и содержание альдегидов как промежуточных продуктов окисления углеводородов (УВ).
Численность клеток определяли посевом на плотные агаровые среды [13]. Каталазную активность определяли газометрическим методом по скорости распада перекиси водорода, выраженной в мл О2 на 1 мл среды за 1 мин [14]. Дегидрогеназную активность определяли по реакции с 2,3,5-трифенил-тетразолия хлоридом (ТТХ) по образованию 2,3,5-трифенилформазана (ТФФ). Количество ТФФ определяли фотоколориметрически при 540 нм. Активность выражали в мг ТФФ, образовавшегося при инкубации 1 мл культуры с 1 мл 1%-ного раствора ТТХ в течение 24 ч [14]. Содержание альдегидов определяли по методу Файгеля с использованием реактива на основе фуксина. Пробу культуральной среды (2 мл) обрабатывали равными объемами сернистой кислоты и фуксинсернистой кислоты. Через 20—30 мин возникает фиолетовое или синее окрашивание. Оптическую плотность раствора определяли фотоколориметрически при 570 нм [15].
Изменение углеводородного состава нефти в конце опыта определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Хромос ГХ-1000 (ЗАО "Химаналитсервис", г. Дзержинск, Россия) с пламенно-ионизационным детектором и капилляр-
ной колонкой длиной 25 м с неподвижной фазой SE 54 ("Sigma-Aldrich", США).
Элементный состав нефти определяли методом сжигания; C, H, N — в реакторе Покровского с последующим газохроматографическим анализом продуктов деструкции, S — колбовым методом по Шенигеру, О — по разнице содержания элементов [16, 17].
Повторность измерений в экспериментах трехкратная при постановке трех независимых серий опытов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета "Statistica for Windows" (програмы "Ехсе1") с доверительным интервалом 0.95. На рисунках приведены данные в виде средних арифметических значений с двусторонним доверительным интервалом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что облучение ассоциации углево-дородокисляющих микроорганизмов P. stutzeri и P.putida светом, трансформированным светокорректирующей пленкой, увеличивает их численность на 2—2.5 порядка по сравнению с контрольными вариантами, т.е. фактически вызывает фотостимуляцию роста микроорганизмов.
Максимальная численность P. stutzeri и P. putida наблюдается на 9 сутки и составляет 1.19—1.2 х х 109 КОЕ/мл соответственно. В контрольных вариантах численность не превышает 6 х 106 КОЕ/мл (рис. 1а, 1б).
Как показано в работах ряда авторов [2, 3], при освещении красным светом стимуляции деления бактерий P. fluorescens предшествует усиление синтеза нуклеиновых кислот и интенсивности дыхания клеток, при этом спектры действия света имеют близкую структуру для разных микроорганизмов. Во всех перечисленных случаях освещение приводило к сокращению длительности лаг-фазы и времени между клеточными делениями, другими словами, происходила фотостимуляция роста микроорганизмов [11].
Существует несколько предположений относительно механизма стимулирующего влияния света на нефотосинтезирующие микроорганизмы:
1) Полагают, что под действием света изменяется ключевой участок в системе регуляции клеточного метаболизма, поскольку модификации подвергаются такие фундаментальные процессы, как синтез белка и клеточное деление. На биохимическом уровне первичная реакция микроорганизмов на световое воздействие была выявлена в ускоренном синтезе РНК. В дальнейшем освещенные клетки характеризовались повышенной скоростью размножения и более быстрым выходом на стационарную фазу роста [2, 5].
2) Существует возможность, что один из центральных элементов системы регуляции жизнедея-
ДЕЙСТВИЕ СВЕТА, ТРАНСФОРМИРОВАННОГО СВЕТОКОРРЕКТИРУЮЩЕЙ
171
120 -
<100 W
О
^ 80
ч 60
о л н Я
о
а
40 -
20
1400
1200
1000
800
600
400
200
Е О К
н 3 с
О
140 г
120 -
5 10 15
Продолжительность опыта, сут
100 -
80 -
ль 60
о тро
н
о Ко
40 -
20 0
1400
1200
1000 s 800 КО
600 , т ы
400 Оп
200
1.6
1.4
1.2
л ъ 1.0
[-1
% 0.8
Ф,
Ф Т 0.6
0.4
0.2
5 10 15
Продолжительность опыта, сут
(б)
5 10 15
Продолжительность опыта, сут
5 10 15
Продолжительность опыта, сут
Рис. 1. Численность Р. stutzeri (а) и Р. putida (б) на свету под светокорректирующей пленкой (3 — опыт). Контроль — пленка ПЭВД (2) и без освещения (1).
Рис. 2. Изменение активности каталазы (а) и дегидро-геназы (б) под светокорректирующей пленкой (3). Контроль — пленка ПЭВД (2) и без освещения (1).
0
0
0
0
0
тельности микроорганизмов, в норме функционирующей вне зависимости от наличия квантов света, обладает светочувствительностью и относится к фо-тохромам — молекулам, способным менять свою пространственную конфигурацию при поглощении кванта света. В этом случае свет вызывает определенные изменения в программе регуляции метаболизма [4].
Например, имеются данные, что при облу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.