научная статья по теме ДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДА В НА КЛЕТКИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE: ВЫХОД ИОНОВ КАЛИЯ И ПОДАВЛЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИФОСФАТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДА В НА КЛЕТКИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE: ВЫХОД ИОНОВ КАЛИЯ И ПОДАВЛЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИФОСФАТОВ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 3, с. 331-335

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 582.282.23.017.73:577.152

ДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДА В НА КЛЕТКИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE: ВЫХОД ИОНОВ КАЛИЯ И ПОДАВЛЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИФОСФАТОВ

© 2008 г. Е. В. Кулаковская*1, А. Ю. Иванов**, Т. В. Кулаковская*, В. М. Вагабов*, И. С. Кулаев*

*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт биофизики клетки РАН, Пущино Поступила в редакцию 19.03.2007 г.

Показано, что целлобиозолипид В, природный фунгицид, продуцируемый дрожжами Pseudozyma fusiformata, вызывает выход K+ и АТФ из клеток Saccharomyces cerevisiae. В присутствии глюкозы целлобиозолипид В действует при меньшей концентрации. Подобрана концентрация целлобиозо-липида В, при которой наблюдается высокая скорость выхода K+, снижение внутриклеточного содержания АТФ в 5-7 раз, а накопление кислоторастворимых полифосфатов уменьшается лишь наполовину. Это свидетельствует о возможности синтеза этих полимеров независимо от уровня АТФ и электрохимического потенциала ионов на мембранах.

Ключевые слова: целлобиозолипид, фунгицид, дрожжи, Ръеыйогута/ш1/отта1а, Saccharomyces сете-visiae, ионы калия, полифосфаты, цитоплазматическая мембрана.

Базидиомицетные дрожжи Pseudozyma fusiformata секретируют в среду целлобиозолипид В (ЦЛ), представляющий собой (2-О-З-гидроксигексаноил-Р-Б-глюкопиранозил-(1—►4)-(6-О-ацетил-Р-Б-глю-копиранозил-(1 —► 16)-2,15,16-тригидроксигексаде-кановую кислоту [1]. Это соединение обладает фун-гицидной активностью против различных видов грибов и дрожжей, в том числе патогенных для человека и животных, что определяет интерес к изучению механизма его действия [2, 3].

Из клеток дрожжей при воздействии данного соединения происходит выход АТФ, они окрашиваются непроникающим красителем бромкрезоль-ным пурпурным, что свидетельствует в пользу того, что фунгицидное действие вызвано нарушением целостности плазматической мембраны [4].

Одним из методов оценки состояния плазматической мембраны у дрожжей является определение выхода из клеток K+, особенно с учетом того, что градиент K+ на мембране представляет собой один из источников энергии для транспортных процессов [5]. Ранее с помощью ингибиторного анализа нами были получены доказательства того, что синтез части неорганических полифосфатов у S. cerevisiae связан с электрохимическим градиентом на плазматической мембране [6].

С целью уточнения механизма действия ЦЛ, нового перспективного фунгицида, в данной ра-

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: alla@ibpm.pushchi-no.ru).

боте изучено его влияние на выход ионов К+ из клеток ^ ceтevisiae. Кроме того, изучено влияние ЦЛ на накопление полифосфатов в клетках дрожжей для выяснения возможной взаимосвязи этого процесса с градиентами ионов на плазматической мембране и уровнем АТФ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения целлобиозолипида В (ЦЛ) использовали дрожжи Pseudozyma fusiformata ВКМ Y-2821 из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Их культивирование и очистку ЦЛ из культуральной жидкости проводили, как описано ранее [1]. Для опытов использовали препарат, хранившийся в виде раствора в метаноле при 5°С.

В качестве тест-культуры использовали дрожжи S. cerevisiae ВКМ Y-1173, которые выращивали до стационарной стадии роста [6, 7]. Выживаемость дрожжей после воздействия ЦЛ определяли путем высева на агаризованную среду [3].

Для регистрации выхода К+ из клеток дрожжей использовали К+-селективный электрод ("Орион", США), связанный с усилителем рН-метра рН-340, который соединяли с самопишущим потенциометром (BD 12, LKB, Нидерланды). Калибровку электрода проводили дробными добавками 0.01 М KCl. В качестве вспомогательного электрода использовали ЭВЛ-1М3.

Выход внутриклеточного К+, % 100

80 60 40 20 0

56

9 11

Время, мин

Рис. 1. Выход К+ из клеток 5. cerevisiae при инкубации при рН 4.0 с целлобиозолипидом В при концентрации 0.14 (1), 0.22 (2) и 0.29 (3) мг мл-1, с 20 мкМ Ag+ (4), а также с 2% метанола (5) и этанола (6).

Перед экспериментами клетки были дважды отмыты в дистиллированной воде и ресуспендированы в ней до концентрации 1.16 х 1010 кл мл-1. Клетки хранили при 4°С в течение 3-4 ч эксперимента.

Измерения проводили в термостатированной ячейке объемом 2.5 мл при 25°С при перемешивании. В измерительную среду, содержавшую 0.01 М цитратно-фосфатный буфер с необходимым рН, вводили 50 мкл клеточной суспензии до конечной концентрации клеток 6-6.5 х 108 мл-1. Общий уровень внутриклеточного К+ у дрожжей определяли после добавления к суспензии 20 мкМ Ag+ или после тепловой обработки клеток при 70°С в течение 15 мин на водяной бане. Уровень К+, определенный с помощью двух указанных видов воздействия, был практически одинаковым.

Выход АТФ из клеток дрожжей под действием ЦЛ определяли люциферин-люциферазным методом с использованием люминометра 1250 (ЬКВ, Швеция) [4]. Контролем служили клетки, к которым добавляли соответствующее количество метанола.

Для определения накопления ортофосфата и полифосфатов использовали клетки 5. cerevisiae, выращенные на среде Ридер, с 1 мМ фосфатом до стационарной стадии. Их инкубировали в растворе 2% глюкозы и 20 мМ КН2Р04. Величину рН раствора доводили до 4.0 лимонной кислотой, концентрация биомассы в этих экспериментах составляла 0.04-0.06 г сырой биомассы на 1 мл. Инкубацию проводили при 30°С в течение 1 ч при перемешивании в присутствии различных концентраций ЦЛ либо при добавлении соответствующего количества метанола. После инкубации клетки осаждали при 5000 g и промывали водой. Затем проводили экстракцию клеток 0.5 N НС104 во льду 10 мин при интенсивном перемешивании. Супернатант, содержащий кислоторастворимые полифосфаты, отде-

ляли центрифугированием при 4000 g 15 мин. Полученные экстракты использовали для определения ортофосфата и лабильного фосфора, по содержанию которого оценивали количество полифосфатов [6, 7].

На рисунках и в таблицах представлены средние значения из трех экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выход К+ под воздействием целлобиозолипида.

Градиент К+ на плазматической мембране дрожжей является источником энергии для транспортных процессов [5]. Измерение выхода этих ионов может быть проведено непосредственно в процессе воздействия фунгицида.

ЦЛ при воздействии на клетки 5. cerevisiae вызывал выход К+, скорость которого зависела от концентрации фунгицида (рис. 1). При повышении концентрации фунгицида выход К+ усиливался и становился таким же, как при воздействии Ag+ [8, 9]. Скорость выхода К+ в присутствии ЦЛ была выше при рН 4, чем при рН 5 (рис. 2). Таким образом, выход К+ из клеток дрожжей, подвергнутых действию ЦЛ, демонстрирует признаки (влияние рН и концентрации гликолипида), сходные с наблюдаемыми при воздействии на выживаемость клеток-мишеней и выхода из них АТФ [1-4]. Выход К+ происходит с первых минут воздействия ЦЛ, что отражает его способность нарушать целостность мембраны на начальном этапе процесса.

Эффект глюкозы. Одним из недостаточно изученных эффектов глюкозы на клетки 5. сеге-visiae является ее сложное воздействие на метаболизм и мембранные процессы [10]. Так, для дрожжей характерна катаболитная репрессия, в присутствии глюкозы не развиваются полноценные митохондрии [11]. Известен глюкозный эффект

ДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДА В НА КЛЕТКИ БАССНАКОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ

333

Выход внутриклеточного К+, %

Время, мин

Рис. 2. Выход К+ из клеток 5. cerevisiae при инкубации с целлобиозолипидом В (0.24 мг мл-1) при рН 4.0. (1) и 5.0 (2), а также при воздействии 20 мкМ Ag+ (3).

активации АТФазы плазматической мембраны, механизм которого остается нераскрытым [12]. Неожиданный эффект глюкозы мы наблюдали при воздействии ЦЛ. В присутствии глюкозы выход К+ наблюдался при меньшей концентрации ЦЛ, чем в контроле, и происходил с большей скоростью (рис. 3). Этанол, который может использоваться 5. cerevisiae, и маннит, который ими не метаболизируется, были использованы в контрольных опытах. Они не приводили к изменению действующей концентрации ЦЛ (рис. 3).

Увеличение чувствительности клеток 5. се^и siae к ЦЛ в присутствии глюкозы наблюдали также при определении выхода АТФ (табл. 1). В присут-

ствии глюкозы количество АТФ, обнаруживаемое в инкубационной среде, при увеличении концентрации ЦЛ вначале возрастало, а затем уменьшалось. Была проведена экстракция диметилсульфоксидом АТФ, остающегося в клетках после воздействия ЦЛ. Количество АТФ в клетках при увеличении концентрации ЦЛ не увеличивалось. Уменьшение количества АТФ, выходящего в среду при высокой концентрации ЦЛ, может быть объяснено тем, что АТФаза плазматической мембраны в этих условиях более интенсивно гидролизует АТФ. Такой эффект известен при повреждениях плазматической мембраны [13, 14].

Некоторое увеличение фунгицидного действия ЦЛ в присутствии глюкозы удается наблюдать также при определении выживаемости клеток (табл. 2). Увеличение чувствительности клеток 5. cerevisiae к повреждающему воздействию ЦЛ в присутствии глюкозы, по-видимому, свидетельствует в пользу того, что глюкоза вызывает перестройки в плазматической мембране дрожжей, делающие ее более подверженной действию этого мембранотропного агента.

Таким образом, ЦЛ может быть использован в качестве агента, позволяющего нарушать целостность плазматической мембраны, и служить для косвенной оценки ее состояния при различных физиологических условиях.

Влияние ЦЛ на накопление неорганических полифосфатов. Если клетки 5. cerevisiae выращивать в условиях дефицита фосфата в среде, а затем помещать в среду с глюкозой и фосфатом, то в них накапливаются полифосфаты. Анализировали фракцию

Время, мин

Рис. 3. Выход К+ из клеток 5. cerevisiae при инкубации с целлобиозолипидом В (0.29 мг мл-1) при рН 4.0 в средах различного состава. 1 - 0.01 М цитратно-фосфатный буфер; 2 - 0.01 М цитратно-фосфатный буфер, 0.1 М маннит; 3 - 0.01 М цитратно-фосфатный буфер, 2% этанола; 4 - 0.01 М цитратно-фосфатный буфер, 0.1 М глюкоза. Этанол и глюкозу вводили в клеточную суспензию за 4 мин до целлобиозолипида В.

Таблица 1. Влияние глюкозы на выход АТФ из клеток S. cerevis

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком