МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 320-325
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.12.013:577.152.3
ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЬУЗОБЛСТЕЯ 8Р. НА ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ
© 2004 г. Е. А. Бегунова, О. А. Степная, И. М. Цфасман, И. С. Кулаев
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино
Поступила в редакцию14.07.03 г.
Изучено действие внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter зр. на грамотрицатель-ные бактерии. Показано, что бактериологические ферменты способны гидролизовать пептидогли-кан, выделенный из клеток этих бактерий. Липополисахарид клеточных стенок полностью ингиби-рует процесс гидролиза пептидогликана бактериолитическими ферментами. Лизис нативных клеток грамотрицательных микроорганизмов становится возможным после изменения проницаемости их внешней мембраны путем обработки клеток этих бактерий полимиксином В.
Ключевые слова: грамотрицательные бактерии, бактериолитические ферменты, лизис, липополисахарид.
Внеклеточные бактериолитические ферменты различных микроорганизмов лизируют широкий спектр грамположительных бактерий [1]. Интактные клетки грамотрицательных бактерий, в основном, не подвергаются лизису под действием бактериолитических ферментов, хотя пептидогликан, выделенный из них, активно гид-ролизуется такими ферментами [2, 3].
По строению клеточной стенки грамотрица-тельные и грамположительные бактерии отличаются друг от друга. У грамотрицательных бактерий тонкий пептидогликановый слой покрыт внешней мембраной. В ее состав входит липополисахарид, состоящий из липида А, кора и олиго-сахарида, который называют О-антигеном. Кроме этого внешняя мембрана содержит фосфоли-пиды, различные липопротеины, белки-порины. Пептидогликан грамположительных бактерий расположен на поверхности клетки, состоит из большого количества слоев и ковалентно связан с анионными полимерами - тейхоевыми или тей-хуроновыми кислотами. Структура пептидогликана грамположительных и грамотрицательных бактерий имеет ряд значительных различий. Так, у грамотрицательных бактерий диамино-кислотой в пептидогликане обычно бывает диа-минопимелиновая кислота, тогда как у грамположительных она встречается довольно редко. В пептидогликанах грамотрицательных бактерий перекрестная связь осуществляется обычно непосредственно между пептидными субъединицами, у грамположительных бактерий как правило через пептидный мостик [4]. Очевидно, что
внешняя мембрана грамотрицательных бактерий защищает пептидогликановый слой от действия бактериолитических ферментов. Известны единичные случаи, когда высокоочищенные бактериолитические ферменты были способны лизировать нативные клетки некоторых грамотрицательных бактерий [5]. Однако механизм их действия на клетки неизвестен.
Бактерия Lysobacter sp. XL 1 [6] секретирует в среду культивирования бактериолитические ферменты - мурамидазу и две бактериолитические пептидазы Л1и Л2 [7-9], а также высокомолекулярный полисахарид [10]. Положительно заряженные бактериолитические ферменты Lysobacter sp. взаимодействуют с отрицательно заряженным полисахаридом. В результате этого взаимодействия образуется внеклеточный фермент-полисахарид-ный комплекс лизоамидаза. Лизоамидаза эффективно лизирует широкий спектр грамположительных бактерий, и лишь два представителя грамотрицательных бактерий - Fusobacterium necroforum и Prevotella melaninogenica [1, 11].
Установлено, что внеклеточные бактериолитические ферменты Lysobacter sp. способны эффективно гидролизовать пептидогликан грамположительных бактерий-мишеней только после того, как произойдет их взаимодействие с анионными полимерами клеточных стенок - тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами [1]. При этом решающую роль играет их отрицательный заряд, а не особенности химической структуры.
Целью представляемой работы явилось исследование возможности и условий лизиса внеклеточными бактериолитическими ферментами Lysobacter sp. грамотрицательных бактерий и влияние на этот процесс липополисахарида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия культивирования.
В работе использовали: активный и малоактивный штаммы Lysobacter sp. (Lysobacter sp. XL 1 и Lysobacter sp. XL 2 [9]), Escherichia coli, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella marcescens, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis из коллекции ГИСК им. Тарасевича, Fusobacterium necroforum, Prevotella melaninogenica из коллекции Московского института стоматологии.
E. coli, P. putida, P. aeruginosa, S. marcescens, F. necroforum, P. melaninogenica, P. vulgaris, P. mirabilis выращивали при 37°С на среде 5/5, разработанной в ИБФМ РАН, следующего состава: аминопептид - 6%, триптон - 0.5%, дрожжевой экстракт - 0.1%, экстракт сои - 3%, рН 7.2.
Lysobacter sp. XL 1 и Lysobacter sp. XL 2 выращивали на среде 5/5 на качалке при 29°С.
Выделение и очистка ферментов. Бактериоли-тический препарат лизоамидазу получали из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL 1, выращенного на опытно-технологической установке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) [11].
Бактериолитическую эндопептидазу Л1 получали из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL 1 методами гель-фильтрации на сефакриле S-200, ионообменной хроматографии на СМ-сефадексе и хроматографии на колонке Mono S в системе FPLC [8].
Очистку бактериолитической пептидазы Л2 и мурамидазы проводили из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL 2 по схеме, включающей ионообменную хроматографию на СМ-сефадексе и ДЕАЕ-Toyopearl и гель-фильтрацию на Toyopearl HW-50F [9].
Определение бактериолитической активности ферментов Lysobacter sp. В качестве субстратов при определении бактериолитической активности использовали лиофильно высушенные авто-клавированные клетки, либо лиофильно-высу-шенные препараты клеточных стенок и пепти-догликана. К 0.5 мл суспензии клеток (клеточных стенок, пептидогликана) c концентрацией 1 мг/мл 10 мМ mpuc-HCl буфера, рН 8.0, имеющей оптическое поглощение 0.8 (к = 540 нм, l = 1 см, Specord), добавляли 100 мкл лизоамидазы (1 мг/мл), или гомогенного фермента: пептидазы Л1 (10 мкг/мл), пептидазы Л2 (4 мкг/мл), мурамидазы (50 мкг/мл) в 10 мМ mpuc-HCl буфере, рН 8.0. Реакцию про-
водили в течение 15-30 мин. при 37°С. За единицу бактериолитической активности (ЛЕ) принимали такое количество фермента, которое приводило к снижению поглощения бактериальной суспензии при X = 540 нм на 0.01 ед. за 1 мин. При определении влияния липополисахарида E. coli на активность бактериолитических ферментов Lysobacter sp. к 0.5 мл суспензии пептидогликана
E. coli (ОП = 0.8) в 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 8.0 добавляли 200 мкл раствора липополисахарида E. coli (20 мг/мл 10 мМ трис-НС1 буфера, рН 8.0) и 50 мкл раствора ферментных препаратов (3 мг/мл 10 мМ трис-НС1 буфера, рН 8.0). Смесь инкубировали 15 мин при температуре 52°С. Затем определяли активность, как описано выше.
Определение бактериолитической активности ферментов Lysobacter sp. по отношению к патогенным грамотрицательным бактериям. Чувствительность клеток P. aeruginosa, S. marcescens,
F. necroforum, P. melaninogenica к лизоамидазе определяли в присутствии полимиксина B.
К 1 мл суспензии исследуемых микробных клеток в 10 мМ трис-HCl буфере, рН 8.0 в стерильных пробирках добавляли стерильно: 1.5 мл раствора лизоамидазы с полимиксином B в том же буфере (конечная концентрация лизоамидазы 1 мг/мл (=10 ЛЕ/мл), конечная концентрация полимиксина -40 мкг/мл (=312 Е/мл)). Полученную смесь инкубировали в термостате при 37°С в течение 24 ч. Затем делали десятикратные разведения и высевали на чашки со средой Луриа-Бертани по 0.1 мл из каждого разведения. После инкубации чашек в термостате при 30°С проводили учет результата действия бактериолитических ферментов Lysobacter sp. подсчетом выросших колоний. Положительным (+) считали результат, когда при высеве на чашки из пробирок, содержащих 107-109 кл/мл, отсутствует рост колоний. Отрицательным (-) - в случае выявления роста колоний.
Количество микробных клеток в исходной суспензии определяли, используя контрольный вариант, в котором к микробной суспензии вместо раствора лизоамидазы добавляли 1.5 мл стерильного 10 мМ трис-HCl буфера, рН 8.0.
Получение пептидогликан-липополисахаридно-го комплекса грамотрицательных бактерий. Пеп-тидогликан-липополисахаридный комплекс грамотрицательных бактерий получали с помощью модифицированных методов Брауна и соавт. [12] и Гудвина и соавт. [13]. 50 г клеток суспендировали в 100 мл 10 мМ трис-HCl, pH 8.0 трижды замораживали при -70°C и оттаивали с перемешиванием. Затем добавляли 3 мг ДНКазы. Полученный гомогенат по каплям добавляли к 150 мл 4% SDS, кипятили 30 мин и оставляли на 12 ч при 4°С. Затем обрабатывали ультразвуком - 2 раза по 30 с и центрифугировали в течение 1 ч при 20000 g.
Таблица 1. Действие внеклеточных бактериологических ферментов Lysobacter sp. на пептидогликан и пептидоклиган-липолисахаридный комплекс E. coli и P. putida
Субстрат Бактериологическая активность ферментов, ЛЕ/мл
Лизоамидаза Л1 пептидаза Л2 пептидаза Мурамидаза
Клетки S. aureus (контроль) 27.9 16.2 6.7 1.5
Пептидогликан E. coli 25.5 7.9 5.8 1.2
Пептидогликан P. putida 15.2 3.3 1.3 0
Пептидогликан-липополисахаридный комплекс E. coli 0 0 0 0
Пептидогликан-липополисахаридный комплекс P. putida 0 0 0 0
Пептидогликан E. coli + липополисахарид E. coli 0 0 0 0
Осадок суспендировали в 100 мл Н2О. Полученную суспензию по каплям добавляли в 150 мл 4% БББ, кипятили 15 мин и оставляли на 12 ч при 4°С. Затем центрифугировали 1 ч при 20000 g. Осадок суспендировали в 125 мл Н2О, обрабатывали ультразвуком в течение 30 с и центрифугировали в течение 10 мин при 20000 g. Полученный осадок отбрасывали, надосадочную жидкость центрифугировали в течение 1 ч при 20000 g. Осадок 3 раза промывали дистиллированной водой, суспендировали в 10 мМ трис-ИС1, рН 8.0, обрабатывали проназой (100 мкг/мл) 3 ч при 37°С, кипятили 15 мин и центрифугировали 1 ч при 20000 g. Полученный осадок пептидогликан-липополисаха-ридного комплекса 3 раза промывали водой и ли-офильно высушивали.
Получение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.