ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2004, том 83, № 10, с. 1261-1269
УДК 599.323.4
ДИАГНОСТИКА МЫШЕЙ РОДА APODEMUS (RODENTIA, MURIDAE) ИЗ ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ БОЛЬШОГО КАВКАЗА В УСЛОВИЯХ СИМБИОТОПИИ
© 2004 г. М. И. Баскевич, С. Г. Потапов, Н. М. Окулова, Ä. Е. Балакирев
Институт проблем экологии и эволюции РАН, Москва 119071 e-mail: mbaskevich@freemail.ru Поступила в редакцию 28.11.2002 г.
C помощью методов дифференциальной окраски хромосом (C-, NOR-banding), молекулярно-гене-тических (RAPD PCR), а также нетрадиционных морфологических (сравнительный анализ структурных и метрических особенностей сперматозоидов) подходов проведен комплексный анализ анонимной выборки мышей рода Apodemus из западной части Большого Кавказа. В составе исследованной анонимной выборки представителей рода Apodemus выявлены следующие, обитающие в условиях симбиотопии, виды: Apodemus (Sylvaemus) ponticus, A. (S.) ciscaucasicus и A. agrarius. Подтверждены хромосомные характеристики, известные ранее для Apodemus [A. (S.) ciscaucasicus и A. (S.) agrarius] из других регионов Кавказа, за исключением незначительных отличий в особенностях локализации гетрохроматина у A. (S.) ciscaucasicus. Найдены новые молекулярно-генетические (для трех видов) и нетрадиционные морфологические признаки (для A. (S.) ciscaucasicus и A. (S.)ponticus), пригодные для дифференциальной диагностики видов-двойников подрода Sylvaemus. Показано, что формы хорошо дифференцированы между собой по всем изученным признакам, а наиболее обособлена среди трех сравниваемых видов A. agrarius. Результаты использованы для уточнения характера географического распространения исследованных видов.
Лесные и полевые мыши рода Аройетш широко распространены преимущественно в широколиственных и смешанных лесах, а также в лесо- и лугостепных ландшафтах гор и равнин Евразии и Северной Африки. Являясь одними из наиболее многочисленных грызунов в местах своего обитания, они наносят существенный вред лесным насаждениям, а также играют важную эпидемиологическую роль, участвуя в циркуляции возбудителей целого ряда природно-очаговых инфекций, таких как геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, клещевой энцефалит и некоторых других (Кулик, 1979; Ткаченко и др., 1987). Очевидно, что разработка методов контроля численности этих важных в экономическом и эпидемиологическом аспектах грызунов возможна только на основе точного знания их систематики и надежной диагностики различных форм.
История изучения систематики лесных мышей рода Аройетш Кавказа полна противоречий. Разногласия касались в основном объема подрода БуЬаетш. Число и состав признаваемых зоологами видов этого подрода в регионе колебалось от одного до трех. Так, С.И. Огнев (1924) выделял один вид: лесную мышь, Аройетш (БуЬае-тш) зуЬайст, А.И. Аргиропуло - два: А. (Б.) syl-vaticus и желтогорлую, А. (Б.) Аау1соШз, а Свириденко П.А. (1936) и Верещагин Н.К. (1959) -три вида мышей: А. (Б.) sylvaticus, А. (Б.) flavicollis
и степную, А. (Б.)^Мре^ш. При этом чаще всего подвергался сомнению видовой статус именно последней формы, и ее рассматривали в качестве подвидов лесной (Огнев, 1924) или желтогорлой (Аргиропуло, 1940; Виноградов, Громов, 1952) мышей. Интересно, что в некоторых случаях признания видового ранга степной мыши, ее происхождение связывали с межвидовой гибридизацией и сим-патрическим видообразованием (Гептнер, 1940; Ларина, 1961). Современные представления о видовом составе лесных мышей Кавказа претерпели коренные изменения благодаря внедрению генетических методов исследования (Воронцов и др., 1988; 1989; Наджафова, 1989; Козловский и др., 1990; БиМоуа й а1., 1991; Боескоров, 1992; Боескоров и др., 1995; Орлов и др., 1996; Челоми-на и др., 1998; 1998а, и др.) и ревизии систематики подрода БуЬаетш (Межжерин, 1991; Воронцов и др., 1992; Орлов и др., 1996).
В настоящее время в фауне Кавказа показано наличие четырех видов-двойников лесных мышей подрода Бу^аетш (род Аройетиs): малая лесная А. (Б.) uralensis [А.(Б.) ciscaucasicus по: Орлов и др., 1996)], кавказская А. (Б.) ponticus, степная А. (Б.) ^Мре^ш и талышская А. (8.) hyrcanicus мыши (Межжерин, 1991; Воронцов и др., 1992; Орлов и др., 1996), хотя некоторые зоологи имеют несколько иную точку зрения на видовой состав кавказских БуЬаетш (Громов, Ербаева, 1995;
Межжерин, 1997; Загороднюк и др., 1997; Frynta et al., 2001). Значительные различия кавказских видов-двойников лесных мышей подрода Sylvae-mus подтверждены электрофоретическими (Воронцов и др., 1988; 1989; Межжерин, 1991; Лав-ренченко, Лихнова, 1995; Челомина и др., 1998), кариологическими (Наджафова, 1989; Козловский и др., 1990; Боескоров, 1992; Bulatova et al., 1991; Боескоров и др., 1995; Орлов и др., 1996; Челомина и др., 1998; Картавцева, 2002), молекуляр-но-генетическими, в том числе основанными на использовании рестрикционного анализа яДНК (Челомина и др., 1998), и морфометрическими (Лавренченко, Лихнова, 1995; Frynta et al., 2001) методами. На основе использования генетических и морфометрических подходов применительно к смешанным выборкам видов-двойников лесных мышей, преимущественно из восточной и центральной частей Кавказа и Закавказья, были разработаны генетические маркеры и дискрими-нантные ключи, позволяющие осуществлять их дифференциальную диагностику. Западная часть Большого Кавказа оставалась в этом отношении наименее исследованной в регионе. Остается открытым вопрос о том, насколько устойчивыми окажутся предложенные диагностические признаки в случае их использования на материале из других регионов Кавказа. Не меньший интерес представляет поиск новых критериев, расширяющих возможности дифференциальной диагностики видов-двойников лесных мышей подрода Syl-vaemus.
Задачей данной работы является поиск ответов на эти вопросы на материале смешанной выборки лесных (n = 12) и полевых (n = 2) мышей с территории Кавказского государственного заповедника в горной части Лазоревского р-на Краснодарского края. Конкретной целью работы является использование кариотипических особенностей для типирования видовой принадлежности, разработка новых молекулярно-генетических маркеров и оценка возможностей использования в качестве диагностических признаков структурных и размерных особенностей сперматозоидов. Авторы настоящего исследования разделяют взгляды Орлова и др. (1996) на видовой состав Sylvaemus на Кавказе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследована серия из 14 экз. Apodemus, отловленных в двух пунктах западной части Большого Кавказа в Лазоревском р-не Краснодарского края, на территории Кавказского заповедника: окрестности пос. Красная поляна (n = 8); окрестности аула Наджиго (n = 6).
Цитогенетический анализ. Препараты мета-фазных хромосом готовили из клеток костного мозга по общепринятой методике (Ford, Hamer-
ton, 1956). Дифференциальное окрашивание хромосомных препаратов проводили с использованием методик С- (Sumner, 1972) и Ag-NOR- (Howell, Black, 1980) окрасок.
Молекулярно-генетические исследования. Для исследования были взяты образцы ДНК, выделенные из фиксированной этанолом печени следующих представителей рода Apodemus: анонимная выборка представителей рода Apodemus, отловленных на Северном Кавказе (14 экз.), а также выборка известных представителей данного рода, включающая в себя виды A. ponticus (3 экз., добытых в окрестностях пос. Ольгинка в Туапсинском р-не Краснодарского края), A. flavi-collis (1 экз. из окрестностей Мантурово в Тверской обл.), A. mosquensis (3 экз. из окрестностей г. Воронеж), и A. agrarius (3 экз. из окрестностей г. Воронеж). В качестве внешней группы был выбран представитель Mus musculus (1 экз., отловленный на территории Центральночерноземного заповедника в Курской обл.).
Выделение ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным методом (Williams et al., 1990). Качество ДНК проверяли на электрофорезе в 0.8% агарозном геле (Sigma), содержащем бромистый этидий.
Был проведен поиск праймеров, пригодных для RAPD-анализа ДНК. Для этого на 3 образцах ДНК различных видов (A. mosquensis, A. ponticus и A. agrarius) были апробированы 60 случайных праймеров длиной 10 нуклеотидов, различающихся по нуклеотидному составу. В результате было отобрано 12 праймеров, дающих наиболее информативный спектр маркеров (амплифициро-ванных анонимных последовательностей ДНК). Реакция амплификации с единичным праймером проводилась по стандартной методике на термо-циклере (MJ Research, USA). Использовали пробирки фирмы "Эппендорф" на 0.5 мл. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 60 мМ трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ сульфата аммония, 0.1% TWEEN 20, по 100 мкМ каждого dNTP, 2.5 мМ MgCl2, 0.1 мкМ праймера, 0.9 единиц Taq-полиме-разы и 25-100 нг тотальной ДНК. Поверх смеси наносили 17 мкл минерального масла.
Использовали следующий режим амплификации: денатурация - 94°C, 1 мин, отжиг - 37°C, 1 мин, элонгация - 72°C, 2 мин. Циклы повторяли 35 раз. Первый цикл предваряли дополнительной денатурацией в течение 2 мин при 94°C. После окончания последнего цикла проводили дополнительную элонгацию в течение 10 мин, а затем температуру снижали до 4°C.
Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле (BRL), содержащем бромистый этидий. В качестве маркеров молекулярного веса использовали коммерческие препараты 100 b.p. Ladder (фирмы Promega) и
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Рис. 1. Диагностические возможности RAPD PCR-анализа представителей рода Apodemus с помощью праймера ОРА-11. 2-15 - диагностируемая анонимная выборка представителей рода Apodemus, отловленных на Северном Кавказе. 16-25 - выборка известных представителей рода Apodemus. 2, 3, 4, 5, 10, 12 - A. ciscaucasicus, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 16, 17, 18 -A. ponticus, 14, 15, 23, 24, 25 - A. agrarius, 19 - A. flavicollis, 20, 21, 22 - A. mosquensis, 26 - Mus musculus, 1 - маркер молекулярных масс 100 bp Ladder, 27 - маркер молекулярных масс М 50.
M 50. Вхождение в гель осуществляли в течение 10 мин при 20 V, разделение фрагментов - в течение 20 ч при 30 V.
Фотографирование геля производили в ультрафиолетовом свете на пленку "Микрат-300".
Сравнит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.