ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 7, с. 814-823
== МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 577.2:616-006.6:575
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТЫ ГЛИКОЛИЗА, ПРИ РАКЕ ПОЧКИ И ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА
© 2013 г. Н. Ю. Опарина1, #, А. В. Снежкина1, #, А. Ф. Садритдинова1, #, В. А. Веселовский2, А. А. Дмитриев1, В. Н. Сенченко1, Н. В. Мельникова1, А. С. Сперанская1, 2, М. В. Дарий1, О. А. Степанов1, 3, И. М. Бархатов4, А. В. Кудрявцева1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: rhizamoeba@mail.ru, oparina@gmail.com 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра высших растений, Москва 119991 3Московский физико-технический институт (Государственный университет), кафедра молекулярной биофизики,
Московская область, Долгопрудный 141700 4Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой, Санкт-Петербург 197089
Поступила в редакцию 01.08.2012 г.
Гликолиз — это основной катаболический путь метаболизма глюкозы, сопровождающийся синтезом АТФ. В гликолизе участвуют более 30 ферментов, кодирующие их гены можно рассматривать в качестве генов "домашнего хозяйства" из-за высокой консервативности и эволюционной древности процесса. С помощью биоинформатического анализа транскриптомных баз данных и метода количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) нами исследована экспрессия этих генов при папиллярном раке почки и плоскоклеточном раке легкого. Количественный анализ уровня мРНК показал, что только часть генов, кодирующих ферменты гликолиза, сохраняет относительно стабильный уровень мРНК — HK1, ADPGK, GPI, PGK1, PKM2 при папиллярном раке почки и ADPGK, ALDOA, GAPDH, PGK1, BPGM, ENO1, PKM2 при плоскоклеточном раке легкого. Впервые методом ПЦР-РВ выявлено частое повышение экспрессии мРНК генов PFKP, ALDOA и GAPDHпри раке почки, а также гена GPI при раке легкого. Для остальных генов показана дифференциальная экспрессия — обнаружены как случаи понижения, так и повышения уровня мРНК. Таким образом, идентифицированы несколько генов, которые могут использоваться в качестве контрольных при транскриптомном анализе методом ПЦР-РВ при раке почки и легкого, а также ряд дифференциально экспрессируемых генов, которые могут быть потенциальными онкомаркерами.
DOI: 10.7868/S0016675813050111
Гены "домашнего хозяйства" — необходимый компонент генома всех клеток многоклеточных организмов. Их экспрессия часто не зависит от тканевой дифференцировки, поскольку кодируемые ими продукты необходимы для нормальной жизнедеятельности клетки. К одному из наиболее древних и консервативных процессов метаболизма относится гликолиз — ферментативный процесс расщепления глюкозы в клетках, сопровождающийся синтезом АТФ. Высокая консервативность и эволюционная древность процесса позволяют рассматривать гены, кодирующие участвующие в гликолизе ферменты, в качестве наиболее вероятных генов "домашнего хозяйства". Действительно, ген, кодирующий фермент ОАРЭИ (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена-за), — один из самых часто используемых "контрольных" генов в исследованиях экспрессии на уровне мРНК [1—3].
# Авторы внесли равный вклад в данное исследование.
В то же время другие гены, белки которых вовлечены в основные этапы гликолиза, согласно различным литературным данным, оказываются дифференциально экспрессирующимися: уровень мРНК различается в ряде тканей в норме и при патологии [4—8].
Изменения транскриптома при канцерогенезе широко изучаются, накоплен значительный объем экспериментальных сведений, доступных для анализа в различных базах данных. Однако большинство полученных данных требуют подтверждения с помощью высокоточного метода количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В результате биоинформатического анализа транскриптомных баз данных нами выбраны гены, белковые продукты которых участвуют в гликолизе у человека, такие как: гексоки-наза 1 (ИК1), фосфоглюкоизомераза Г-6-Ф (ОР1), фосфофруктокиназа (РБКР), альдолаза А (АЬЭОА), альфа-энолаза 1 (£N01), глицеральде-гид-фосфатдегидрогеназа (ОАРЭИ) и др. (рис. 1). Нами проведена оценка стабильности экспрес-
НК1 АТр ADPGK ADP
Глюкоза
1
Глюкозо-6-фосфат
GPl|t
2
Рис. 1. Последовательность реакций гликолиза. В рамках указаны субстраты гликолиза и каталитические ферменты. Обратные стрелки показывают обратимые реакции.
сии генов, кодирующих основные ферменты гликолиза, в нескольких типах злокачественных новообразований различной локализации. Методом ПЦР-РВ количественно оценили уровень мРНК генов, для которых показана возможность нарушения стабильности экспрессии в образцах папиллярного рака почки, а также плоскоклеточного рака легкого. Полученные данные демонстрируют нарушения одного из базовых метаболических путей при раке почки и легкого, а также позволяют предложить ряд генов в качестве контрольных для оценки экспрессии генов методом ПЦР-РВ в образцах папиллярного рака почки и плоскоклеточного рака легкого.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализ транскриптомных баз данных
Анализ коротких экспрессирующихся нуклео-тидных последовательностей (EST) нормальных и опухолевых тканей базы dbEST [9] проведен с помощью разработанной нами программы "CompEST" и сервиса GeneHub GEPIS [10]. Использовали EST из клонотек NCBI [9], полученных из нор-
мальных клеток почки и легкого человека и соответствующих злокачественных опухолей, при этом использовали как данные недостаточно полной аннотации (описанные как "kidney cancer" или "lung cancer"), так и клонотеки с большим набором метаданных. Из анализа были исключены клонотеки, относящиеся к редким типам опухолей.
Нами проведен дополнительный отбор клонотек EST с помощью поиска в базе данных dbEST по ключевым словам "kidney", "renal", "lung" (при дополнительном фильтре — "использование только клонотек из тканей и клеток человека"). Отобраны только те клонотеки, которые отвечают следующим критериям: представительность клонотеки превышает 600 EST, среди нуклеотид-ных последовательностей EST присутствуют не менее двух "тагов" EST, соответствующих, по крайней мере, одному из рекомендованных для экспериментального нормирования контрольных генов ACTB, GUSB, TBP, RPN1, PPIA [11, 12]. Отобранные нуклеотидные последовательности EST для каждого типа ткани человека были разбиты на две группы — соответствующие нормаль-
ной и опухолевой ткани. Из рассмотрения были исключены EST с неясной аннотацией, полученные из смешанных тканевых препаратов и из клеточных линий. Соотнесение набора EST с соответствующими генами человека проводили согласно геномному выравниванию EST по данным базы UCSC [13], версия hg19.
На первом этапе сравнили уровни мРНК исследуемых генов, затем полученные результаты сопоставили с данными гибридизации кДНК на микрочипах. После предварительного нормирования на EST, соответствующие набору контрольных генов, с помощью программы CompEST проведено сравнение представленности "тагов" в клонотеках, относящихся к опухолевым и нормальным тканям. При этом были исключены EST, не содержащие экзон-экзонных границ (поскольку они могут представлять собой продукты загрязнения препарата примесью геномной ДНК), а также EST со значительными отклонениями в нуклеотидной последовательности от известных мРНК аннотированных белок-кодирую-щих генов человека (>15% замен, содержащих повторяющиеся геномные элементы и отличающихся от известных мРНК по экзон-экзонным границам). Такой подход позволил выявить гены, уровень трансляционно-активных мРНК которых наиболее достоверно изменяется при раке почки и легкого.
Поскольку данные клонотек EST не всегда содержат достаточно описаний, было применено дополнительное исследование уровня экспрессии генов, связанных с гликолизом, с использованием данных гибридизации кДНК на микрочипах базы данных Oncomine [14]. Для каждого из генов был определен уровень экспрессии и его изменение в наборе образцов папиллярного рака почки и плоскоклеточного рака легкого.
Образцы тканей, выделение РНК, получение кДНК
Образцы тканей плоскоклеточного рака легкого (I—III стадий) и папиллярного рака почки (I— IV стадий) и прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани (т.н. "условные нормы") были собраны и затем охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Клинический диагноз подтвержден патоморфо-логическим исследованием в Отделении патологической анатомии опухолей человека РОНЦ РАМН. В исследовании использовали по 10 образцов каждого гистологического типа рака. Процент опухолевых клеток в образцах составил не менее 70.
Тотальную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов нормальных и опухолевых тканей с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit ("Qiagen"). Концен-
трацию и качество РНК определяли на биоанализаторе Bioanalizer Agilent 2100. В работе использовали образцы, для которых показатель RIN (RNA Integrity Number) составлял не менее 8. Для всех образцов РНК получали одноцепочечную кДНК, в реакцию добавляли по 1 мкг тотальной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I ("Fermentas"), гексануклеотидные праймеры и обратную транскриптазу M-MuLV ("Fermentas"). Реакцию проводили в следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 50°С - 10 мин, 70°С - 10 мин.
Метод ПЦР-РВ
Измеряли относительный уровень мРНК, который представляет собой отношение количества копий транскрипта каждого гена в опухоли к количеству его копий в нормальных тканях. Для оценки уровня мРНК целевых генов в образцах плоскоклеточного рака легкого и папиллярного рака почки в качестве контрольных генов использовали RPN1 и GUSB. Уровень мРНК контрольных генов в реакции изменялся в опухолях по сравнению с нормой в среднем не более чем в два раза [12]. Таким образом, учитывая биологическую вариабельность контрольных генов, при анализе данных, полученных для различных типов опухолей, рассматривали изменения уровня мРНК исследуемых генов от двух и более раз.
Для оценки уровня мРНК генов использовали коммерческие наборы (Applied Biosystems), при помощи которых амплифицируются ПЦР-про-дукты только с кДНК, исключая возможность амплификации геномно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.