БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 8, с. 999 — 1008
УДК 578.247
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЛИПОСОМАМИ, НЕСУЩИМИ В БИСЛОЕ ЛИПОФИЛЬНЫЕ ПРОЛЕКАРСТВА МЕТОТРЕКСАТА И МЕЛФАЛАНА*'**
© 2014 Н.Р. Кузнецова, Е.Л. Водовозова***
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; электронная почта: elvod@lipids.ibch.ru
Поступила в редакцию 26.03.14 После доработки 23.04.14
При контакте с плазмой крови наноразмерные частицы мгновенно покрываются так называемой белковой «короной», качественный и количественный состав которой определяет поведение наноносителя в кровотоке и, в конечном счете, фармакокинетику и биораспределение инкапсулированного лекарства. В свою очередь, состав белковой короны зависит от свойств поверхности наночастицы, а именно, от размера, распределения заряда и функциональных групп. Липосомы относятся к наиболее био- и гемосовместимым носителям, которые пригодны для внутривенного введения, необходимого при химиотерапии метастазирую-щих опухолей. Однако картина взаимодействия липосом различного состава с белками плазмы крови остается фрагментарной. Более того, потенциально все наноразмерные носители являются объектами действия врожденной иммунной системы, в первую очередь, системы комплемента (СК), что является причиной развития реакций гиперчувствительности различной степени тяжести. Недавно в тестах на гемосовместимость in vitro нами было показано, что липосомы из природных фосфолипидов — яичного фосфатидилхолина и фосфатидилинозита из S. cerevisiae, — нагруженные в бислое диглицеридными конъюгатами противоопухолевых препаратов мелфалана или метотрексата, не влияют на морфологию и численность основных форменных элементов крови человека. Однако в отличие от инертных препаратов с пролекарством мелфалана, метотрексат-содержащие липосомы вызывали нарушения в системе коагуляции крови и активировали СК. Целью настоящей работы явилось исследование взаимодействия липосом, несущих пролекарства мелфала-на и метотрексата, с белками плазмы крови in vitro. Данные анализа общей адсорбционной способности липосом (количество связываемого белка) с помощью классической гель-хроматографии позволяют прогнозировать относительно быстрое выведение их из кровотока. С помощью иммуноблоттинга в профилях связывания белков выявлен ряд различий между липосомальными препаратами, который согласуется с полученными ранее данными о влиянии на СК. Обсуждается возможный механизм активации СК метотрексат-содержащими липосомами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: наномедицина, противоопухолевые липосомы, мелфалан, метотрексат, липофиль-ные пролекарства, белковая корона, система комплемента.
Как и макроматериалы, при контакте с биологическими средами, в первую очередь, с плазмой крови, наноразмерные частицы мгновенно покрываются белками и их комплексами с ли-
Принятые сокращения: СК — система комплемента; Mlph-DOG — диглицеридный конъюгат мелфалана; МТХ-DOG — диглицеридный конъюгат метотрексата; PBS — физиологический раствор, приготовленный на фосфатном буфере; РС — фосфатидилхолин; PI — фосфатидилинозит; Mlph-L — липосомы, несущие Mlph-DOG; МТХ-L — липосомы, несущие МТХ-DOG; PB — количество связываемого белка (protein binding).
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-078, 22.06.2014.
*** Адресат для корреспонденции.
пидами (липопротеинами) [1—4]. Так называемая белковая «корона» модифицирует физико-химические свойства поверхности носителей лекарств, в том числе липосом. Эффективной единицей доставки является не наночастица как таковая, а комплекс, образуемый наночастицей и более-менее прочно связанными с ее поверхностью белками. Именно с «короной» липосом взаимодействуют клеточные рецепторы в организме, поэтому качественный и количественный состав сорбированных белков определяет биораспределение инкапсулированного препарата и его фармакокинетику. В свою очередь, состав белковой «короны» зависит от свойств поверхности липосом, а именно, их размера, распределения заряда и функциональных групп
на поверхности. Варьирование этих параметров может лишь изменить количество связываемого частицей белка и состав белковой короны, но не исключить связывание вовсе [5].
Традиционно взаимодействия липосом с белками плазмы крови рассматривались в контексте опсонизации поверхности и связанной с этим проблемой преждевременного вывода липосом из кровотока клетками ретикуло-эндоте-лиальной системы [6]. Сегодня выявленные для липосом закономерности поведения в биологических средах дополняются сведениями о других наноразмерных системах доставки лекарств (полимерных мицеллах, дендримерах, полиэлектролитных комплексах), предпринимаются попытки систематизировать полученный массив данных [3]. Однако картина взаимодействия липосом с белками остается фрагментарной. В связи с этим специальное исследование поведения новых липосомальных препаратов при их контакте с плазмой крови является актуальным.
Липосомы, как и другие супрамолекулярные системы доставки лекарств, построенные из не-иммуногенных изначально молекул, схожи с патогенными вирусами человека не только по своим размерам, но и по структуре поверхности, поскольку на ней могут формироваться молекулярные матрицы и повторяющиеся элементы, которые распознаются рецепторами иммуно-компетентных клеток. Поэтому потенциально наноразмерные носители являются объектами действия врожденной иммунной системы, в первую очередь, системы комплемента (СК) [7]. Со времени внедрения в клинику собран обширный материал о реакциях гиперчувствительности, которые наблюдаются в ответ на введение в кровоток таких препаратов как Doxil® (липосомы с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином во внутреннем водном объеме, стабилизированные привитыми на поверхности длинными цепями полиэтиленгликоля, так называемые пегилированные липосомы) [8] и Taxol® (эмульсия цитостатика паклитаксела, стабилизированная фармакопейным детергентом Cremophor®EL) (например, [9]).
С целью улучшения фармакологических свойств химиотерапевтических препаратов нами предложено включать их в липидный бислой 100-нм липосом в виде липофильных проле-карств — сложноэфирных конъюгатов с липида-ми [10—12]. Недавно в тестах на гемосовмести-мость in vitro нами показано, что липосомы из природных фосфолипидов, нагруженные дигли-церидными конъюгатами мелфалана или ме-тотрексата (Mlph-DOG и МТХ-DOG соответственно, рис. 1), не влияют на основные форменные элементы крови человека — эритроциты
и тромбоциты [13]. Однако в отличие от инертных препаратов с пролекарством мелфалана, метотрексат-содержащие липосомы вызывали нарушения в системе коагуляции крови и активировали СК — индуцировали выработку ана-филатоксина C3a и заметно истощали СК в целом, согласно результатам определения остаточной гемолитической активности сыворотки крови [13].
Очевидно, что нарушение функционирования каскадов коагуляции и системы комплемента обусловлено взаимодействиями липосом с белковыми факторами и уменьшением вследствие этого количества доступного интактного белка в плазме. Так, концентрации различных факторов коагуляции в плазме очень низки и составляют 20, 10 и 200 нМ для факторов V, VII (в активированной плазме) и X соответственно, в то время как концентрация фибриногена, одного из основных белков плазмы, — 9 мкМ [14]. Поэтому даже незначительная (не)специфичес-кая адсорбция одного из факторов коагуляции на поверхности липосом может привести к значимому сдвигу равновесия реакций каскадов.
Целью настоящей работы явилось исследование взаимодействия липосом, нагруженных Mlph-DOG и МТХ-DOG, с белками плазмы крови in vitro. Сначала была определена простейшая количественная характеристика — общая адсорбционная способность липосом, или количество связываемого белка (protein binding, PB). Этот показатель может служить прогностическим фактором для сравнительной оценки времени циркуляции в кровотоке лекарственных липо-сом на основе новых липидных композиций [4, 6]. Затем с помощью иммуноблоттинга связанных белков был выявлен ряд различий между липосомальными препаратами, что позволило сделать предположения о механизме активации СК метотрексат-содержащими липосомами, которую мы наблюдали в крови in vitro [13].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Диглицеридные конъюгаты мелфалана [15] и метотрексата [16] синтезировали, как описано. Использовали фосфатидилхолин (РС) из яичного желтка и фосфатидилинозит (PI) из S. cere-visiae производства «Реахим» (Россия), сефарозу CL-4B («Pharmacia», США), ЭДТА и остальные реагенты производства фирм «Sigma» и «Flow Laboratories» (США). Растворители очищали стандартными методами; упаривания проводили в вакууме при температурах не выше 40°. Готовили буферы с 1 мМ ЭДТА: PBS, pH 7,1 — физиологический раствор на фосфатном буфере
Рис. 1. Структуры липофильных пролекарств Mlph-ООО и МТХ-БОО и схематическое изображение липосомы
(КН2Р04, 0,2 г/л; NaH2PO4 ■ 2H2O, 0,15 г/л; Na2HPO4, 1,0 г/л; KCl, 0,2 г/л; NaCl, 8,0 г/л).
Получение липосом. Липосомы (L) состава PC — PI - MTX-DOG/Mlph-DOG, 8 : 1 : 1 (мол.), получали методом экструзии через калиброванные ядерные фильтры как описано ранее [10, 13]. Смесь липидов и пролекарства упаривали в круглодонных пробирках из растворов в хлороформе на роторном испарителе. Обычно смеси содержали по 12,5 мг PC, 1,6 мг PI и 2,4 мг (2 мкмоль) MTX-DОG или 1,8 мг (2 мкмоль) Mlph-DОG. Липидные пленки высушивали 30 мин при 5 Па, затем гидратировали в течение 2 ч при комнатной температуре в 0,5 мл PBS. Суспензию встряхивали, подвергали 5-кратной процедуре замораживания-оттаивания (жидкий азот -+40°) и продавливали 20 раз через поликарбонатные мембранные фильтры («Nucleo-pore», США) с размером пор 100 нм с помощью установки Mini-extruder от «Avanti Polar Lipids» (США). Концентрацию пролекарств в дисперсиях определяли после разрушения липосом 20-кратным разбавлением в этаноле: регистрировали УФ-спектры и измеряли оптическую плотность в максимумах поглощения (MTX-DОG: А,макс 302 нм, в ~25
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.