УДК 576.524
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ОСТЕОБЛАСТОВ: РОЛЬ АДГЕЗИВНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КЛЕТОК С СУБСТРАТОМ
© 2013 г. Н. А. Глушанкова1, Д. В. Штанский2
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24;
электронная почта: natglu@hotmail.com;
2Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС", 119049, Москва, Ленинский проспект, 4; электронная почта: shtansky@shs.misis.ru Поступила в редакцию 27.06.2012 г.
Рассмотрены клеточные и молекулярные механизмы регуляции процесса дифференцировки остеобластов, вклад сигнальных путей и транскрипционных факторов. Ключевым регулятором остеоге-неза считается транскрипционный фактор Яипх2, который индуцирует синтез белков, специфичных для остеобластов — щелочной фосфатазы, матриксной металлопротеиназы-13, костного сиало-протеина, коллагена типа I, остеокальцина. Адгезивные взаимодействия клеток с подлежащим субстратом важны для процессов пролиферации преостеобластов, остеогенной дифференцировки, минерализации внеклеточного матрикса. Эффективное прикрепление и распластывание клеток на подложке определяется фокальными контактами и актиновым цитоскелетом. Фокальные контакты являются механосенсорными структурами. Посредством трансмембранных рецепторов — интегри-нов, участвующих в образовании фокальных контактов, клетки остеогенного ряда реагируют на ригидность клеточных субстратов, их химический состав и топографию поверхности. Киназа фокальных контактов БАК является ключевым игроком сигнализации, связанной с фокальными контактами. Микро- и нанотопография поверхности существенным образом влияет на остеогенную дифференцировку.
Ключевые слова: остеобласты, дифференцировка, фокальные контакты, интегрины.
DOI: 10.7868/S0233475513010040
Остеобласты образуются из мезенхимных стволовых клеток в ходе остеогенной дифференцировки — сложного многостадийного процесса, в основе которого лежат адгезивные взаимодействия клеток с межклеточным матриксом, активация внутриклеточных сигнальных путей и транскрипционная регуляция экспрессии ряда генов [1, 2]. На первой стадии преостеобласты проходят через интенсивную пролиферацию, которая сменяется дифференцировкой, в ходе которой начинается синтез щелочной фосфатазы, костного сиалопротеина (BSP), секретируется коллаген типа I, формирующий внеклеточный матрикс [3, 4]. На поздних этапах дифференци-ровки остеобласты экспрессируют остеокальцин и остеопонтин, начинается минерализация внеклеточного матрикса (отложение гидроксиапати-та) и формирование костной ткани [1, 2].
Ключевой регулятор остеогенеза — транскрипционный фактор Runx2, активирует дифферен-цировку мезенхимных стволовых клеток по остеогенному пути, а также регулирует экспрессию многих генов преостеобластов и остеобластов [4, 5]. Белок Runx2 образован несколькими
доменами, которые могут взаимодействовать с корепрессорами и коактиваторами. Runx2 связывается с ^ис-элементом 2 (OSE2), входящим в состав промоторной области генов, специфичных для остеогенной дифференцировки. Экспресси-рованный в мезенхимных стволовых клетках экзогенный Runx2 индуцирует синтез белков, специфичных для остеобластов, включая остеокаль-цин, щелочную фосфатазу, коллагеназу-3, матриксную металлопротеиназу-13, костный си-алопротеин, коллаген типа I [5—7].
Ряд сигнальных путей, в том числе сигнальные пути Wnt, TGF-p, PI3K/Akt, регулируют созревание остеобластов и их дифференцировку [2]. Члены семейства TGF-p - BMP-2, BMP-7, BMP-6 и BMP-9 (ВМР — bone morphogenetic proteins) запускают остеогенную дифференцировку мезен-химных стволовых клеток и играют в ней важную роль [8]. Рецепторы BMP (BMPR-I) и II (BMPR-II) являются серин-треониновыми протеинкиназа-ми. После связывания с лигандом киназа BMPR-I активируется в результате фосфорилирования киназой BMPR-II. Активированные рецепторы BMP рекрутируют и фосфорилируют белки R-Smad,
которые затем перемещаются в клеточное ядро и активируют ряд транскрипционных факторов [2]. Ключевой эффектор, опосредующий действие BMP, — ген Dlx5, индуцирующий синтез Osterix и Runx2 [9—11]. В результате кооперативного действия Runx2 и Smad5 индуцируется синтез щелочной фосфатазы, костного сиалопротеина, остеокальцина [4, 10, 12, 13]. BMP2 также стимулирует ацетилирование Runx2 через SMAD, тем самым защищая его от протеолиза, индуцируемого Smurf1 [14]. В дополнение к пути Smad BMP также индуцирует остеогенную дифференциров-ку через Erk, р38 и сигнальные пути JNK MAPK, Р13К/АЙ и NF-kB [4, 15-17]. Транскрипционные факторы Osterix, NFATc1, Twist, AP-1 и ATF4 вовлечены в регуляцию остеогенной диффе-ренцировки [2, 10, 18]. ATF4, в частности, контролирует синтез коллагена типа I и остеокаль-цина [19, 20].
Сигнальный путь Wnt-p-катенин важен для дифференцировки остеобластов. В отсутствие сигналов р-катенин рекрутируется комплексом, состоящим из белка АРС (adenomatous polyposis coli), аксина, киназ GSK3p и казеинкиназы 1, в котором N-концевое фосфорилирование р-кате-нина по серину-треонину служит сигналом для его убиквитинирования и последующей протеа-сомной деградации. Wnt-сигналы индуцируют взаимодействие комплекса Frizzled—Dishevelled с корецепторами LRP5/6, что приводит к рекрутированию аксина к плазматической мембране, блокированию деградации р-катенина, перемещению его в ядро и образованию комплекса с транскрипционными факторами TCF/LEF. Комплекс TCF/LEF—р-катенин с участием коактива-торов p300/CBP инициирует транскрипцию многих генов, вовлеченных в процесс дифференци-ровки остеобластов [21, 22].
Как показали многочисленные исследования, адгезивные взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, в частности с фибронектином, коллагеном типа I и витронектином, важны для пролиферации преостеобластов, остеогенной дифференцировки, минерализации внеклеточного матрикса [23—26]. Взаимодействие клеток костной ткани и подлежащего субстрата играет ключевую роль при замещении костных дефектов имплантатом, а установление прочной связи между костной тканью и имплантатом является залогом успешного заживления. Исследование интерфейса кости и имплантата показало, что ме-зенхимные стволовые клетки и преостеобласты мигрируют на поверхность имплантата в течение первых суток, где прикрепляются и распластываются [1, 27]. Эффективное прикрепление и распластывание клеток необходимо для остеогенной дифференцировки [28, 29].
Прикрепление клеток к подлежащему субстрату осуществляется посредством фокальных контактов (фокальных адгезий), тесно связанных
со структурами актинового цитоскелета [30, 31]. Главными молекулами фокальных контактов, обеспечивающими прикрепление клеток к подложке, являются трансмембранные рецепторы — интегрины, состоящие из а- и р-субъединицы [32]. Интегрины считаются главными сенсорами, чувствительными к биохимическим и биофизическим характеристикам клеточных субстратов. Посредством интегринов клетки реагируют на ригидность клеточных субстратов, их химический состав и топографию поверхности как локально — влияя на сборку адгезионных структур, так и системно — активируя внутриклеточные сигнальные пути, регулирующие пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [1, 2]. Так показано, что транскрипционная активность Runx2 может регулироваться сигналами от фокальных адгезий через МАРК-каскад. Ингибитор ERK — PD98059 угнетал существенное повышение уровня транскрипционной активности Runx2 и минерализации матрикса при культивировании остеобластов на титановой подложке [16].
Рецептор фибронектина (а5р1-интегрин) играет ключевую роль в остеогенной дифференци-ровке мезенхимных стволовых клеток человека. Экспрессия а5-субъединицы интегрина резко усиливала остеогенный потенциал мезенхимных стволовых клеток [33]. Разрушение связи между а2-интегрином и внеклеточным матриксом антителами к домену коллагена типа I, ответственному за связывание с клетками, блокировало индукцию остеокальцина и минерализацию внеклеточного матрикса при стимуляции дифференцировки остеобластов аскорбиновой кислотой [34].
Используя интегриновые рецепторы, клетки остеогенного ряда могут оценивать качество подлежащего субстрата. Изучение остеокондуктив-ности различных типов подложек показано, что микро- и нанотопография поверхности может существенно влиять на остеогенную дифференци-ровку. Получены данные об активации пролиферации и индукции экспрессии генов остеогенной дифференцировки in vitro при культивировании остеогенных клеток на шероховатых металлических подложках [35]. На примере дентальных им-плантатов установлено, что остеоинтеграция более эффективно протекает в случае шероховатых, но не гладких имплантатов [36—39]. Опубликованы данные об экспрессии маркеров дифференци-ровки при культивировании мезенхимных стволовых клеток на плоских подложках с наноотвер-стиями, расположенными в порядке, близком к регулярному, а также на подложках с ямками диаметром порядка 10 мкм и глубиной 100 нм [40, 41]. Вместе с тем показано, что при культивировании клеток остеогенной природы на бороздках шириной 350—500 нм на подложках с нановыпук-лостями или нерегулярными наноотверстиями, а также на подложках, покрытых частицами разме-
ром около 100 нм, резко угнетается адгезия, пролиферация и дифференцировка клеток [42—44].
Фокальные контакты относятся к механосен-сорным структурам. Степень жесткости субстрата в дополнение к биохимическим стимулам может влиять на направление дифференцировки мезен-химных стволовых клеток: на мягком субстрате эти клетки дифференцируются в нервные клетки, на субстрате средней жесткости — в мышечные, на жестком субстрате — в остеобласты [45]. Имеются данные о том, что внешние механические стимулы также способны влиять на дифференци-ровку клеток остеогенной природы [46].
Молекулярные механизмы клеточной адгезии изучены достаточно подробно. При взаимодействии с лигандами гетеродимеры а- и ß-интегри-нов рекрутируют в область адгезии целый комплекс внутриклеточных белков (паксиллин, вин-кулин, талины, киндлины, тензин, киназы FAK, ILK, фосфатазы, p130Cas, G-белки) [47]. Талины и киндлины связывают интегрины с актином, и это взаимодействие изменяет конформацию ди-меров а- и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.