ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 6, с. 684-689
УДК 579:222
ДИГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА В ПОЛОЖЕНИЯХ 7a И 15a МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ
© 2009 г. Т. Г. Лобастова, С. А. Гулевская, Г. В. Суходольская, М. В. Донова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
e-mail: lobastova@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 16.07.2008 г.
Изучена способность 485 грибных штаммов катализировать процесс 7а,15а-дигидроксилирования дегидроэпиандростерона (ДГЭА, 3ß-гидрокси-5-андростен-17-она) - ключевого интермедиата синтеза физиологически активных соединений. Способность к образованию 3ß,7а,15а-тригидрокси-5-андростен-17-она (7а,15а-ди-ОН-ДГЭА) впервые установлена для представителей 12 родов 8 семейств и 6 порядков аскомицетов, 8 родов 4 семейств и 1 порядка зигомицетов, 1 рода 1 семейства и 1 порядка базидиомицетов и 4 родов митоспоровых грибов. Наиболее активные штаммы выявлены среди родов Acremonium, Gibberella, Fusarium и Nigrospora. При трансформации ДГЭА (2 г/л) штаммами Fusarium oxysporum VKM F-1600 и Gibberella zeae BKM F-2600 мольный выход 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА составил 63 и 68% соответственно. Применение найденных активных штаммов микроорганизмов открывает перспективы эффективного получения ключевых интермедиатов синтеза современных лекарственных препаратов.
Гидроксилирование является одной из важнейших реакций функционализации стероидной молекулы. Использование микроорганизмов позволяет в одну технологическую стадию осуществлять ре-гио- и стереоспецифическое введение одной или нескольких гидроксильных групп в стероидное ядро и является альтернативой многостадийному и, часто, малоэффективному химическому синтезу гидрок-систероидов. Введение гидроксильных групп в молекулу стероида способны эффективно осуществлять микроорганизмы различной таксономической принадлежности [1-3]. В связи с высокой физиологической активностью известных и вновь синтезируемых гидроксилированных стероидных соединений постоянно продолжается поиск микроорганизмов с высокой гидроксилазной активностью. Наиболее изучены процессы гидроксилирования 3-кето-4-ен-стероидов прегнанового и андростаново-го ряда в положениях 9а, 11а, 11 в, 14а и 16а. Однако микробиологическое введение гидроксильных групп в молекулу 3Р-гидроксистероидов без структурной модификации кольца А менее известно [46]. Между тем, недавние открытия в области фармации показали важную роль таких соединений в формировании иммунного и эндокринного ответа организма на стрессовые воздействия, при лечении расстройств памяти и сна, при использовании в качестве антиконвульсантов и нейропротекторов [79].
Известно, что структура кольца А стероидной молекулы оказывает существенное влияние на положение вводимой гидроксильной группы. Замена 3-кето-4-ен на 3-гидрокси-5-ен-конфигурацию может приводить к изменению позиции гидроксили-
рования. Например, Mucor piriformis осуществлял процесс введения гидроксильной группы в молекулу 3-кето-4-ен-стероидов андростанового и прегнанового ряда преимущественно в 14а-положение [10], в то время как при трансформации дегидроэпиандростерона ^-гидрокси-5-андростен-17-она, ДГЭА) и прегненолона ^-гидрокси-5-прег-нен-20-она) этой же культурой позиция гидроксильной группы изменялась на 7а [11]. Первичное ал-лильное гидроксилирование 4-ен-стероидов культурой термофильного гриба Rhizomucor tauricus IMI23312 осуществлялось в позиции 6, а 5-ен-стеро-идов - в положении 7 [12]. B ряде случаев реакция гидроксилирования сопровождалась превращением 3ß-гидрокси-5-ен в 3-кето-4-ен-группировку [13, 14].
Способность к образованию 7а- и 7ß-гидрокси-производных 3ß-гидрокси-5-ен стероидов из ДГЭА и прегненолона показана для представителей родов Fusarium [5, 15, 16], Mucor [11], Rhizopus [17] и ряда других родов [6]. Гидроксилирование в 15а-положе-нии ДГЭА и прегненолона описано для Fusarium graminearum [15] и F. culmorum [16].
Осуществление в одну биотехнологическую стадию двойного гидроксилирования ДГЭА в положениях 7а и 15а открывает перспективы эффективного получения 3ß,7a,15a-тригидрокси-5-андро-стен-17-она (7а,15а-ди-ОН-ДГЭА) - ключевого интермедиата в синтезе фармакологически значимых стероидов, антагонистов альдостерона, таких, как 6ß ,7ß,15 ß,16ß-диметилен-3-оксо-17a-прегн-4-ен-21,17-карболактон [18].
Однако сведения в литературе по 7а,15а-дигид-роксилированию ДГЭА микроорганизмами огра-
ничены. Ранее сообщалось об осуществлении этой реакции с помощью культур Gibberella saubinetti [19] и Colletotrichum lini [18, 20]. Образование 7а,15а-дигидроксипроизводных наблюдали при трансформации прегненолона, 5-андростен-17-она и 5-андростен^-ола культурой Fusarium culmorum [16].
Цель работы - исследование способности мице-лиальных грибов к проведению процессов направленного введения гидроксильных групп в положения 7а и 15а дегидроэпиандростерона и выявление наиболее перспективных в биотехнологическом отношении штаммов, образующих 3ß,7а,15а-тригид-рокси-5-андростен-17-она (7а,15 а-ди-ОН-ДГЭА).
МЕТОДИКА
Материалы. Использовали ДГЭА фирмы "Sigma" (США), 7а-гидроксидегидроэпиандростерон (3 ß,7а-дигидрокси-5 -андростен-17-он, 7а-ОН-ДГЭА), 7а,15 а-дигидроксидегидроэпиандросте-рон (3 ß,7a,15 а-тригидрокси-5-андростен-17-он, 7а,15 а-ди-ОН-ДГЭА) были получены от фирмы "Schering AG" (Германия). Все стероиды были аналитической чистоты. Другие материалы и растворители марок х.ч. и ч.д.а. были получены от российских компаний.
Микроорганизмы и культивирование. Все штаммы, использованные в работе, были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН). Штаммы выращивали на роторной качалке (200 об/мин) при 29°С в колбах Эрленмейе-ра (750 мл), содержащих 50 мл жидкого сусла или глюкозно-картофельной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 20, K2HPO4 -15.2, KH2PO4 -18.1, картофельный настой - до 1 л (pH 6.5).
Трансформация ДГЭА. После 24-72 ч роста индивидуальные культуры в объеме 10% вносили в среду инкубации (50 мл) следующего состава (г/л): сахароза - 50, KH2PO4 - 5.0, MgSO4 - 5.0, кукурузный экстракт (жидкий) - 20 мл, дистиллированная вода - до 1 л (pH 6.5). ДГЭА вносили в виде порошка в среду до стерилизации. Содержание субстрата составляло 0.5 при скрининге и 2 г/л - в экспериментах с наиболее активными штаммами. Трансформацию проводили в колбах Эрленмейера (750 мл) на роторной качалке (200 об/мин) при 29°С в течение 96-144 ч. Анализ продуктов трансформации ДГЭА осуществляли методами ТСХ и ГЖХ.
Анализ стероидов. Образцы культуральной жидкости (1 мл) отбирали каждые 24 ч. Стероиды экстрагировали 5 мл этилацетата.
ТСХ проводили с использованием пластинок УФ 254 ("Сорбфил", Россия) в системах: бензол-ацетон (5 : 3, об./об.) - (А); бензол-этилацетат-аце-тон (1 : 1 : 1) - (Б) или бензол-ацетон (3 : 1) - (В). Визуализацию 3ß-гидрокси-5-ен-стероидов осуществ-
ляли обработкой пластинок ТСХ 4%-ной фосфор-но-молибденовой кислотой (ФМК) в этаноле с последующим прогреванием при 60-65°С в течение 3-5 мин.
Для проведения ГЖХ 1-1.5 мл этилацетатного раствора упаривали досуха при 60°С, к осадку добавляли внутренний стандарт (200 мкл пиридинового раствора холестерина, содержащего 120 мкг (1 вариант) или 20 мкг (2 вариант) холестерина), и 0.6 мл силанизирующей смеси (гексаметилдисила-зан-триметилхлорсилан-пиридин, 3 : 1 : 9), нагревали пробу при 65°С в течение 1 ч. Пробы анализировали на приборе "Hewlett Packard 5890" (США) с кварцевой колонкой (15 м х 0.25 мм х 0.2 мкм) с по-лидиметилсилоксановой неподвижной фазой SPB-1. Использовали разные режимы ввода пробы: 1) с делением потока газа-носителя (гелий), 2) без деления потока (задержка 0.5 мин, коэффициент деления потока 20). Объем вводимой пробы составлял 2 мкл; температура испарителя и детектора 280 и 300°С, соответственно (1-й вариант); 200 и 300°С (2-й вариант). Температурная программа анализа: вариант 1 - от 150°С (задержка 1 мин) со скоростью 10°С/мин до 285°С (задержка 7 мин); вариант 2 - от 100°С (задержка 1 мин) со скоростью 8°С/мин до 290°С (задержка 5 мин). Использовали плазменно-ионизационный детектор с регистрацией на интеграторе HP 3396А ("Hewlett Packard", США). Экспериментально найденные калибровочные коэффициенты ДГЭА, 7а-ОН-ДГЭА, 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА по холестерину составляли 1.16, 1.00 и 0.83 соответственно.
Масс-спектры продуктов трансформации были получены на масс-спектрометре "Finnigan MAT SSQ710" (США) с непосредственным введением образца в ионизационную камеру при энергии ионизации 70 эВ.
Выделение стероидов. После 48-96 ч трансформации при достижении максимального содержания соединения 1 (Rf 0.28, система А) содержимое колб дважды экстрагировали равным объемом этилацетата, упаривали до 2-3 мл. Стероиды выделяли методами колоночной хроматографии и препаративной ТСХ. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 ("Merck", Германия, 0.040-0.063 мм, 16 х 450 мм), используя смесь гек-сан-этилацетат в различном процентном соотношении. Хроматографическую чистоту стероидов контролировали методом ТСХ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поиск мицелиальнын грибов с 7а,15а-дигидрокси-лазной активностью. При тестировании 485 штаммов способность к образованию 7а,15а-ди-ОН-ДГЭА из ДГЭА была выявлена для представителей всех исследованных подцарств, за исключением Oomycota. При этом было отмечено широкое видовое и родо-
Таблица 1. Таксономическое положение штаммов, осуществляющих 7а,15а-дигидроксилирование ДГЭА
Порядок Семейство Род Вид
Подцарство Ascomycota
Dothideales Leptosphaeriaceae Coniothyrium fuckelii
Mycosphaerellaceae Cladosporium herbarum
Pleosporaceae Bipolaris Curvularia Phoma australiensis, cynodontis, spicifera geniculata, inaequelis glomerata
Eurotiales Trichocomaceae Penicillium adametzii, allahabadense, aurantio-flammiferum, brevi-compactum, citreonigrum, clavigerum, daleae, digi-tatum, duclauxii, gallaicum, gerundense, grancanariae, griseofulvum, hispanicum, islandicum lanosum, lividum var. thomii, onobense, palmense, paxili, phoeniceum, ver-ruculosum
Hypocreales Hypocreaceae Cylindrocarpon Fusarium Gib
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.