МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 805-813
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.218
ДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕРМИНАЛЬНОЙ ГРАНУЛЫ piNG-ТЕЛЬЦА В СЕМЕННИКАХ Drosophila melanogaster
© 2014 г. Г. А. Носов1, М. В. Кибанов2, Л. В. Оленина2*
биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991 2Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182 Поступила в редакцию 11.04.2014 г. Принята к печати 17.04.2014 г.
Изучены динамические характеристики piNG-тельца — крупной околоядерной гранулы, обнаруженной в сперматоцитах семенников Drosophila. piNG-тельце содержит рибонуклеопротеиновые комплексы, вовлеченные в piРНК-сайленсинг геномных повторов, включая транспозоны, в премейотических сперматоцитах с участием коротких piРНК. Конфокальная микроскопия фиксированных и нативных препаратов семенников показала, что piNG-тельце — подвижная структура, не занимающая постоянного положения у поверхности ядра относительно хромосомных территорий. FRAP-анализ выявил высокую скорость обмена молекул РНК-хеликазы \asa в составе piNG-тельца и малых околоядерных гранул с цитозольным пулом \asa. Нарушение сборки микротрубочек цитоскелета не влияет на стабильность piNG-тельца и малых гранул. Мы предполагаем, что сочетание подвижности piNG-тельца и постоянного обмена молекул белка \asa обеспечивает эффективное "сканирование" всего объема цитоплазмы первичных сперматоцитов и своевременное распознавание и разрушение нежелательных транскриптов повторяющихся элементов генома.
Ключевые слова: терминальные гранулы, nuage, piNG-тельце, Drosophila melanogaster, FRAP, piPHK, повторы Stellate.
DYNAMIC PROPERTIES OF GERMINAL GRANULE piNG-BODY IN THE TESTES OF Drosophila melanogaster, by G. A. Nosov1, M. V. Kibanov2, L. V. Olenina2* ^Moscow State University, Moscow, 119991 Russia; 2Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 123182 Russia; *e-mail: olenina_ludmila@mail.ru). Here we investigated dynamic properties of the piNG-body, large perinuclear granule that was discovered previously in spermatocytes of Drosophila. The piNG-body contains ribonucleoprotein complexes involved in piRNA-silencing of genome repeats including transposons in premeiotic spermatocytes with aid of short piRNAs. Confocal microscopy of fixed and native preparations demonstrates that the piNG-body is mobile structure which does not occupy a stationary position near nuclear surface relative to chromosomal territories. FRAP-analysis reveals a high exchange rate of RNA helicase Vasa in the piNG-body and small perinuclear granules with the cytozol Vasa pool. Disruption of microtubule assembly of cytoskeleton does not affect to stability of the piNG-body and small granules. We suppose that the combination of piNG-body mobility and permanent molecular exchange of Visa protein provides an efficient "scanning" of total volume of the cytoplasm of primary spermatocytes and timely recognition and destruction of unwanted transcripts of the repetitive elements of genome.
Keywords: germinal granules, nuage, piNG-body, Drosophila melanogaster, FRAP, piRNA, Stellate repeats.
Б01: 10.7868/80026898414050115
Клетки зародышевого пути многих животных содержат специфические рибонуклеопротеиновые гранулы, обычно расположенные в цитоплазме вблизи ядра. В эмбриональных гоноцитах самцов млекопитающих терминальные гранулы представлены рь и р1Р-тельцами, а в постмейотических круглых сперматидах взрослых особей — хромато-
* Эл. почта: olenina_ludmila@mail.ru
идным тельцем, единственным на клетку [1—3]. В питающих клетках ооцитов Drosophila melanogaster подобные гранулы образуют околоядерную структуру, называемую nuage [4, 5]. Исследования последних лет свидетельствуют об участии nuage в образовании коротких регуляторных piPHK и осуществлении piPHK-зависимого сайленсинга
ретротранспозонов и других вредоносных элементов генома [6, 7]. piPHK-путь является эволюцион-но консервативным механизмом, обеспечивающим поддержание функциональной целостности генома в терминальных тканях многих животных [8]. В составе pi- и piP-телец, в хроматоидном тельце найдены белки, участвующие в piPHK-зависимом сай-ленсинге [1—3]. В составе nuage Drosophila также выявлены гомологичные белки, участвующие в подавлении активности ретротранспозонов посредством piPHK-сайленсинга: Aubergine, AGO3, Vasa, Spindle-E, Armitage, Tudor, Krimper, Tejas и другие [4—7, 9]. В первичных сперматоцитах Drosophila охарактеризованы два типа гранул nuage [10]. Гранулы первого типа диаметром приблизительно 0.6 мкм во множестве разбросаны по внешней поверхности ядер, подобно nuage в питающих клетках яичников. Гранулы второго типа, названные piNG-тельцами, — значительно более крупные образования диаметром примерно 2.4 мкм. В большинстве сперматоцитов встречается одна такая гранула. piNG-тельце имеет дольчатую структуру. Белок AGO3 обнаружен в центральной доле, тогда как остальные идентифицированные компоненты, в том числе Aubergine, входят в состав внешних долей. Мутационный анализ показал, что образование piNG-телец ассоциировано с сайленсингом вредоносных повторов Stellate [10], являющихся основной мишенью системы piPHK-сайленсинга в первичных сперматоцитах Drosophila [11, 12].
РНК-хеликаза Vasa считается ключевым архитектурным фактором nuage, поскольку привлечение в состав гранул всех остальных изученных на сегодняшний день белков-компонентов зависит от присутствия Vasa [4, 6, 10, 13]. Нарушение экспрессии Vasa приводит к разрушению гранул nuage и повреждению механизма piPHK-зависимого сайленсин-га как в яичниках, так и в семенниках Drosophila, вызывая мобилизацию ретротранспозонов и сверхэкспрессию повторов Stellate [10, 12—14]. Помимо nuage Vasa присутствует также в цитоплазме сперматоци-тов и питающих клеток [5]. Недавно показали, что в питающих клетках яичников Vasa привлекается к цитоплазматической стороне ядерных пор, через которые происходит экспорт транскриптов piPHK-предшественников при участии ядерной РНК-хе-ликазы UAP56 [15]. Предполагается, что одна из функций Vasa в nuage заключается в захвате и фиксации транскриптов, экспортированных из ядра, и презентации их факторам, осуществляющим дальнейший процессинг.
Эксперименты с нефиксированными препаратами яичников мух, несущих трансгенную конструкцию Vasa-GFP, показали, что nuage это стабильная околоядерная структура питающих клеток, осуществляющая обмен молекулами белка с цито-плазматической фракцией [5]. В этой же работе в
первичных сперматоцитах Drosophila впервые обнаружили малые гранулы nuage. Однако к настоящему моменту неясными остаются процессы формирования и динамики piNG-тельца, его взаимоотношения с малыми гранулами nuage. Положение piNG-тельца может быть связано с положением XY-хро-мосомной территории в ядре, где происходит образование транскриптов Stellate. Настоящая работа посвящена изучению формирования, динамики обмена Vasa в герминальных гранулах сперматоци-тов, подвижности piNG-тельца и взаимоотношениям между piNG-тельцем и малыми гранулами nuage с помощью конфокальной микроскопии фиксированных и нефиксированных препаратов семенников, экспрессирующих Vsa-GFP.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Линии Drosophila. В работе использовали семенники и яичники взрослых особей D. melanogaster линии Vasa-GFP [1б].
Микроскопия нефиксированных препаратов (live-imaging). Возможность проведения длительных "live-imaging" экспериментов с семенниками Drosophila была показана ранее [17]. Гонады препарировали в охлажденной среде Ковпакова (С-4б) [18]. Изолированные органы промывали и помещали на предметное стекло в каплю среды. Временный микропрепарат анализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM S1G META ("Carl Zeiss", Германия). Изображения с разрешением S12 x S12 и 1G24 x 1G24 пикселей получали при увеличении объектива бЗ xHCX PL APO с масляной иммерсией. Для наблюдения подвижности piNG-тельца съемку проводили в течение 1 ч c пятиминутными интервалами. Изображения анализировали с использованием программы Imaris S.G.1 ("Bitplane", Швейцария).
Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP). Для проведения FRAP-анализа изолированные органы помещали в среду Ковпакова и готовили временный препарат. Фотовыжигание Vasa-GFP в интересующей зоне проводили с помощью облучения лазером с длиной волны 4ВВ нм. Данные по фотовосстановлению анализировали с помощью программы FRAP Analyzer (University of Luxemburg, Люксембург, http://act-insim.uni.lu/eng/Downloads/FRAPAnalyser) и пакета Exel. Параметры FRAP-анализа: (I) сканирование: размер рамки — S12 x S12 пикселей, скорость сканирования — В, цифровое увеличение — 2, пропускание лазера — 2%, режим сканирования — непрерывное; (II) выжигание: пропускание лазера — 1GG%, количество импульсов — 1GG, единовременно. При проведении FRAP помимо выжигаемой области регистрировали также интенсивность флуоресценции цитозоля сперматоцита
(или питающей клетки) и флуоресценцию piNG-тельца (или гранул nuage) в соседних клетках. Первый параметр использовали для учета снижения содержания флуоресцентной конструкции в клетке после фотовыжигания, второй — для учета выгорания флуоресцентной метки, происходящего при съемке. С помощью программы FRAP Analyser проводили нормализацию графика FRAP с учетом этих параметров. После этого в каждом эксперименте измеряли время полувосстановления флуоресценции и долю подвижной фракции Vasa-GFP
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Семенники взрослых самцов D. melanogaster линии Vasa-GFP препарировали в охлажденном фосфатно-солевом буфере, однократно промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0.1% TWeen-20 (ФСБТ) и фиксировали в 3.7%-ном растворе формальдегида в ФСБТ в течение 30 мин при комнатной температуре. Все последующие процедуры проводили согласно [19]. Для визуализации ядрышка использовали антитела к фибрилларину ab5821 в разведении 1 : 100 ("Abcam", Великобритания), микротрубочек — антитела к a-тубулину DM1A в разведении 1 : 500 ("Sigma", США). Вторичные антитела, конъюгиро-ванные с флуорофором A
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.